Transcript Avaliação da viabilidade celular pela técnica do MTT

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA EXPERIMENTALLABIOEX
Avaliação da viabilidade celular pela
técnica do MTT
Ms. Karina Bettega Felipe
Florianópolis, maio de 2011
1. Princípio
2. Amostra
 Células aderentes cuja viabilidade celular deseja-se avaliar
após o seu tratamento com o composto/extrato em estudo.
3. Reagentes/soluções/suspensão celular
 Meio de cultura completo: meio DMEM alto teor de glicose
suplementado com soro fetal bovino (10%) e solução de
antibióticos
penicilina
10.000u/mL
e
estreptomicina
10.000µg/mL (1%);
 Solução de MTT (0,5mg/mL)- Preparar 10 mL
Pesar 5mg de MTT/ Adicionar 1mL de PBS/ Adicionar 9mL de
meio de cultura completo
 Suspensão celular na concentração de 0,5X105 células/mL
4. Procedimento
 Preparar uma suspensão celular na concentração de
0,5X105 células/mL:
a) Retirar o meio de cultura da garrafa
b) Lavar a garrafa com PBS
c) Adicionar a tripsina
d) Esperar a tripsina reagir
e) Preparo do meio de inativação
f) Inativar a tripsina
g) Divisão do conteúdo da garrafa em dois tubos falcon
h) Centrifugar as células
i) Retirar meio com tripsina
j) Ressuspender as células em meio simples
k) Contar as células
Nº céls/mL= nº céls
contadas/4 x diluição da
câmara X diluição amostra
Nº céls /mL=nº céls
contadas/4 x 104 X 10
l) Preparar suspensão 0,5 X105 células por mL
-200 µl/ poço X 96 poços = 19,2 mL
- Contagem de células: 5 X 105 células/mL
-Número de células necessárias:
0,5 X105 células – 1000µl
X
- 19200µl
X= 9,6 X105 células
- Quantos µl da suspensão celular terá 9,6 X105 células?
5 X105 células – 1000µl
9,6X105 células- X
X= 1920µl
5 X105 células – 1000µl
100µl (0,5 X105 células) – 1000µl
0,5 X105 células - X
X
X= 100µl
- 19200µl
X= 1920
- Suspensão utilizada para o teste:
- Precisaremos de 19.200µl 1920µl de soro
192µl de antibiótico
1920µl da suspensão celular
15168µl de meio
 Preparo da suspensão celular
 Adicionar 200µl da suspensão celular em cada poço
24h
Retirar o meio de cultura
TRATAMENTO
24, 48 ou
72 h
Doxorrubicina (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/mL)
200µL
1000µL
Solução mãe
100µg/mL
(1000µg/mL)
1800µL meio
1000µL
50µg/mL
1000µL
25µg/mL
12,5µg/mL
1000µL meio 1000µL meio 1000µL meio
1000µL
1000µL
3,125µg/mL
6,25µg/mL
1000µL meio
1000µL meio
1
2
3
4
5
6
7
8
A
CTRL
100
50
25
12,5
6,25
3,125
CTRL
100
50
25
12,5
6,25
3,125
CTRL
100
50
25
12,5
6,25
3,125
B
C
D
E
F
G
H
9
10
11
12
24h
Retirar o meio de cultura
TRATAMENTO
24, 48 ou
72 h
O que vocês vão fazer!!!
Preparar
solução
MTT
Retirar o
meio
5’
Lavar os
poços 2X
com PBS
Adicionar
DMSO
2h
Estabilização
da cor
5’
540 nm
 Preparo da solução de MTT (0,5mg/mL)
a) Preparo da solução estoque a 5mg/mL
-
Pesar 5mg de MTT
-
Solubilizar em 1,0 mL de PBS estéril.
b) Preparo da solução de uso (0,5mg/mL)
CV=CV
5mg/mL X V = 0,5mg/mL X 10 mL
V= 1mL da solução estoque
+ 9 mL de meio completo
900µl de soro + 90µl de antibiótico + 8010µl de meio
O que vocês vão fazer!!!
Preparar
solução
MTT
Retirar o
meio
5’
Lavar os
poços 2X
com PBS
Adicionar
DMSO
2h
Estabilização
da cor
5’
540 nm
 Cálculos
Descontar o branco !
Fazer a média da
absorbância
Considerar o controle como 100% de
células viáveis e fazer regra de três para
determinar a viabilidade celular das
amostras