Transcript Diagnóstico: Herramientas convencionales aplicadas según la

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO
PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA
ENFERMEDAD DE CHAGAS
- Herramientas convencionales aplicadas según la
etapa (métodos parasitológicos e inmunológicos).
- Reactivos disponibles en el medio.
Bioq. Natalia Peralta
Parasitología y Micología
Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia.
Universidad Nacional de San Luis
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
 La
Enfermedad de Chagas es una de las
endemias más importantes en nuestro país,
siendo uno de los problemas de Salud Pública
de mayor distribución en América Latina.
 Para
su correcto diagnóstico se deben
evaluar los datos clínicos, de laboratorio y
epidemiológicos.
 El
laboratorio juega un rol fundamental y
muchas veces determinante en el
diagnóstico de la infección.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
 La
enfermedad de Chagas presenta tres
etapas clínicas:
aguda
b) indeterminada
c) crónica
a)
Debemos tener en cuenta el período ventana que se
produce cuando T.cruzi ingresa al organismo, cumple sus
primeros ciclos de desarrollo en el hospedador, que abarca
entre 7 a 15 días, período después del cual recién se
pueden detectar parásitos circulantes y posteriormente
anticuerpos contra el parásito.
DIAGNÓSTICO DE
LABORATORIO
Por esto es fundamental conocer tres
aspectos:



Cuándo realizar un análisis
Qué análisis realizar
Cuales son los objetivos del análisis
Para evitar la realización de estudios parasitológicos
y/o serológicos en un momento inadecuado, con
la consecuencia de posibles falsos resultados
negativos.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
Luego del período de Ventana
se presentan
parasitemias, las que van disminuyendo a medida
que transcurre el tiempo, hasta hacerse mínimas
o aleatorias.
ETAPA AGUDA
El diagnóstico de laboratorio debe centrarse en la
búsqueda del parásito.
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
ETAPAS INDETERMINADA y CRÓNICA
El diagnóstico se realiza mediante la
demostración de anticuerpos específicos anti
Trypanosoma cruzi.
MÉTODOS SEROLÓGICOS
DIAGNÓSTICO DE
LABORATORIO
En nuestro país, el diagnóstico serológico
debe efectuarse por dos reacciones
en paralelo, y en caso de discordancia,
se debe recurrir a una tercera prueba a fin
de definir el resultado.
ETAPA AGUDA
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS
TOMA DE MUESTRA
MOMENTO DEL CONTAGIO
Deben realizarse al menos DOS pruebas serológicas
para Chagas, a los fines de conocer si el paciente
tiene ya una infección previa.
Si la misma es negativa
la segunda muestra
debe ser obtenida respetando el periodo de
ventana desde el inicio de la posible infección.
ETAPA AGUDA
En esta etapa deben realizarse
fundamentalmente los
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS,
los cuales pueden ser realizados por distintos
procedimientos analíticos, dependiendo de la
disponibilidad de recurso humano capacitado y
equipamiento en cada laboratorio.
La DETECCIÓN DEL PARÁSITO, como en toda
enfermedad infecciosa, es el único parámetro de
CERTEZA DIAGNÓSTICA.
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS
GOTA FRESCA
GOTA GRUESA
TÉCNICA DE CONCENTRACIÓN DE STROUT
MICROSTROUT / MICROMÉTODO
HEMOCULTIVO
XENODIAGNÓSTICO
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDA
METODOS PARASITOLÓGICOS-GOTA FRESCA
Aumentar
irrigación
gota de citrato al 2%)
10x / 40x
45 minutos
Trypanosoma cruzi
Sensibilidad 50%
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDA
MÉTODOS PARASITÓLOGICOS-GOTA GRUESA
Colorear con Giemsa
diluido (1/20) 30
minutos.
Lavar y secar
1-2min
Dejar secar
Colocar 1 a 3 gotas
Desfibrinar
objetivo de 100x
aceite
Trypanosoma cruzi
Sensibilidad 50%
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDA
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS-STROUT
Sobrenadante
Retracción
del
coágulo
600 rpm
2 min.
Suero
2500 rpm
10 min.
5-10 mL
Tº amb
Sedimento
Objetivos de 10x y 40x
(45 minutos)
Sensibilidad 95%
DIAGNÓSTICO
DE LABORATORIO-
ETAPA AGUDA
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS-MICROMÉTODO
/MICROHEMATOCRITO
BIOSEGURIDAD
Cerrar extremo con
plastilina
Cortar
45 segundos a 5000 rpm
6 a 9 microhematocrito heparinizado
Objetivos de 10x y 40x
(45 minutos)
Sensibilidad 90 a 95%
La técnica de MICROHEMATOCRITO NO ES
RECOMENDABLE






Puede brindar falsos resultados negativos:
Si el capilar es centrifugado a las revoluciones no adecuadas, existe la
posibilidad de que los parásitos se vayan al fondo del capilar con el riesgo
de no ser visualizados.
Que el paciente curse con bajas parasitemias y sea muy difícil de observar
la presencia del parásito en la interfase, entre la capa de glóbulos
blancos y el suero.
Si el capilar se rompe en la interfase, pueden quedar restos de vidrio del
capilar sobre el portaobjetos con los restos de la interfase y cuando se
coloca el cubreobjeto, no tiene una adecuada adherencia y dificulta la
observación.
Por razones de Bioseguridad del operador:
Ya que para su observación deben cortarse aproximadamente 7 capilares,
para aumentar su sensibilidad y los restos de vidrios pueden traspasar los
guantes del operador e incluso herirlo, sin que éste lo perciba, pudiendo
adquirir infecciones como Hepatitis, HIV, Chagas, etc.
DIAGNÓSTICO
DE LABORATORIO-
ETAPA AGUDA
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS-NUEVO
MICROMÉTODO
Tubo Eppendorf
(1,5 ml de capacidad)
Mezclar por inversión
1 gota de heparina
+
0,5 ml de sangre venosa
1 min a 3000 rpm
Tomar una gota
de la interfase
(capa de glóbulos
blancos)
Objetivos de 10x y 40x
(45 minutos)
Sensibilidad 90 a 95%
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDA
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS-HEMOCULTIVO

Consiste en sembrar una muestra de sangre en
un medio de cultivo artificial y amplificar el
número de parásitos. Como producto del cultivo
se obtienen epimatigotes de T. cruzi.
Existen técnicas estandarizadas con sangre
heparinizada, recolectada en condiciones
de estricta asepsia, en medio monofásico
(Infusión Cerebro Corazón) y bifásico
(pico de flauta de agar sangre).
Se incuba a 28ºC y se realizan
observaciones microscópicas y subcultivos
periódicos, desde los 7 y hasta un máximo
de 60 días.
El método del hemocultivo es de elección
por su menor agresividad para los
pacientes, fundamentalmente en la
población neonatal, mayor precocidad de
resultados y menor requerimiento en
infraestructura.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO- ETAPA AGUDA
MÉTODOS PARASITOLÓGICOS-XENODIAGNÓSTICO

Consiste en amplificar el nº de parásitos utilizando al vector.

Se utilizan ninfas de Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio.

Se realiza con la aplicación de 4 cajas con 20 ninfas de
Triatoma infestans, del tercer o cuarto estadio, con 20
días de ayuno, cubiertas con una gasa, sujetada con una
banda elástica. Se sujeta al antebrazo durante 15 o 20
minutos.

Luego se deja a 28ºC y 70% de humedad durante 30 o 60
días. El material se obtiene por compresión de la zona
abdominal del insecto, entre dos pinzas, sobre un
portaobjetos, y se lo diluye con solución fisiológica
estéril, luego se agrega un cubreobjeto y se observa con
objetivo de 40x , recorriendo aproximadamente 300
campos en guarda griega.
Enfermedad de Chagas
Diagnóstico parasitológico
ventajas
desventajas
Strout,
Microstrout
Resultado precoz
Certeza diagnóstica
Sencillez operativa
Bajo costo
Sensibilidad operador
dependiente
Hemocultivo
Elevada sensibilidad
Certeza diagnóstica
Facilidad en la
obtención de
la muestra
Bajo costo
Requiere experiencia
del operador
Contaminaciones
Xenodiagnóstico
Gold standard
Método cruento
Reacciones alérgicas
Infraestructura
compleja
En resumen, los métodos parasitológicos
clásicos: EXAMEN EN FRESCO, STROUT O
MICROSTROUT y HEMOCULTIVO empleados
secuencialmente, permiten detectar el
parásito, y consecuentemente efectuar el
diagnóstico de certeza, prácticamente en
el 95% de los casos durante el período
agudo.
ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICA
MÉTODOS SEROLÓGICOS
El concepto básico que debe tenerse en
cuenta es que lo que se busca no es el
parásito y, por lo tanto, sus resultados
nunca proporcionan certeza diagnóstica y
deben medirse en términos de
probabilidad.
Para que las probabilidades de éxito en el
diagnóstico serológico se acerquen a la
certeza es imprescindible seleccionar
adecuadamente
El MÉTODO A EMPLEAR,
EL MOMENTO DE LA TOMA DE MUESTRA
e INTERPRETAR ADECUADAMENTE LOS
RESULTADOS.
MÉTODOS SEROLÓGICOS
Los métodos actualmente validados son:
- HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA (HAI)
- ELISA (Enzyme-Linked Inmuno Sorbent Assay)
- INMUNOFLUORESCENCIA(IF)
DIAGNÓSTICO
DE LABORATORIO-
MÉTODOS SEROLÓGICOS

ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICA
- HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
Se basa en la propiedad que tienen las proteínas de adsorberse
sobre la superficie de glóbulos rojos de carnero o de ave
modificada químicamente y actuar como soporte del antígeno.
Si en el suero del paciente existen anticuerpos contra los
antígenos del parásito, los glóbulos rojos se aglutinan.
DIAGNÓSTICO
DE LABORATORIO-
MÉTODOS SEROLÓGICOS

ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICA
- ELISA
Consiste en placas de poliestireno con antígenos solubles del
Trypanosoma cruzi pegados. Sobre cada uno de los reservorios de
la placa se coloca suero de pacientes que, si tienen anticuerpos se
unen a los antígenos del Tripanosoma.

Luego se agrega un reactivo constituído por anticuerpo anti
inmunoglobulinas humanas marcado con una enzima (peroxidasa o
fosfatasa alcalina) y posteriormente, se agrega un sustrato de la
enzima que, si en la fase sólida se encuentra el doble complejo
antígeno- anticuerpo del paciente- anticuerpo marcado, desarrolla
un color cuya intensidad es proporcional a la concentración de
anticuerpos del paciente y a la afinidad de los mismos.
DIAGNÓSTICO
DE LABORATORIO-
MÉTODOS SEROLÓGICOS

ETAPA INDETERMINADA Y CRÓNICA
- INMUNOFLUORESCENCIA
Tiene un fundamento similar al método de ELISA, con algunas
diferencias importantes. La primera es que el antígeno es
particulado (el parásito entero fijado con formaldehído o
glutaraldehído). La segunda diferencia radica en que el segundo
anticuerpo está marcado con una sustancia fluorescente,
ususalmente isotiocianato de fluoresceína y, por último, la lectura
se realiza en un microscopio equipado con luz UV.
Los parámetros para determinar la confiabilidad de un método son:
- Sensibilidad (S)
- Especificidad (E)
- Valor predictivo (VP)
S: capacidad de un método de dar resultado (+) en presencia de infección.
E: capacidad de un método de dar resultado (-) en ausencia de infección.
VP: probabilidad que un individuo con resultado (+) esté realmente infectado (VP+)
o de que un individuo con resultado (-) sea realmente no infectado (VP-).
Las dos primeras son intrínsecas del método, en cambio el VP depende de la
prevalencia de la infección. Así, en zona de alta endemicidad el VP+ de un
resultado positivo es más alto que en una zona no endémica (y por lo tanto la
probabilidad de resultado falso positivo es menor).
Como ningún método tiene 100% de E, las pautas
para diagnóstico de la infección chagásica (Manual
para la atención del paciente infectado con
Trypanosoma cruzi. Ministerio de Salud de la
Nación. 2005) determinan que, para que un
individuo sea considerado chagásico, deben dar
positivos al menos dos métodos serológicos
diferentes:
ELISA + HAI
ELISA + IF
HAI + IF
Actualmente, la reacción más sensible
es ELISA que, por otra parte, si se
cuenta con un espectrofotómetro de
lectura vertical (lector de ELISA),
tiene la ventaja de la objetividad.
Permite procesar elevado número de
muestras.
La prueba de HAI tiene la ventaja de
permitir la titulación del nivel de
anticuerpos con rapidez y sencillez
operativa y también es adecuada para
procesamiento de elevado número
de muestras.
Respecto a la IF, sin dudas se trata de
una buena metodología, pero requiere
experiencia del operador y depende de
la subjetividad del mismo.
Por otra parte, el equipamiento
requerido no está al alcance de
pequeños laboratorios y no es una
técnica adecuada para procesar
elevado número de muestras.
EN UN LABORATORIO DEBEN ESTAR
DISPONIBLES AL MENOS DOS PRUEBAS,
DE ACUERDO A LA COMPLEJIDAD DEL
MISMO, LA INFRAESTRUCTURA
DISPONIBLE Y LA FORMACION
PROFESIONAL.