Transcript ALCAPTONURIA

Rosales ,Gabriela
Aragón, Carolina
Zambrano, Karen
ALCAPTONURIA
Cordero, Belén
Martín, Vanesa
Ortiz, Malena
¿QUE ES LA AKU?
 Enfermedad autosómica recesiva poco
frecuente, en la cual el ÁCIDO
HOMOGENTISICO no es metabolizado.
 La enzima deficiente es la ÁCIDO
HOMOGENTISICO OXIDASA.
 HGA se acumula y causa la triada
característica de la enfermedad: aciduria,
ocronosis y artritis.
aciduria
artrititis
ocronosis
VÍA METABÓLICA
 Uno de los síntomas más
característicos: ORINA NEGRA. Debido a que
HGA se excreta en grandes cantidades en
orina.
Cuando esta se expone al aire se
vuelve oscura.
OCRONOSIS
 Es un trastorno caracterizado por el depósito de un
pigmento marrón-negruzco en el tejido conectivo y en el
cartílago, como resultado de la acumulación de ácido
homogentísico.
 Generalmente, el primer cambio que se presenta es una
ligera pigmentación de las escleróticas o los oídos.

 La pigmentación aparece con la transpiración, por lo que la piel
puede presentar una descoloración parduzca en la región de las
axilas y los genitales.
 Exámenes microscópicos, muestran que el pigmento es depositado
intercelular e intracelularmente y puede ser granular u homogéneo.
 El pigmento depositado en la ocronosis es un polímero derivado del
ácido homogentísico, pero su estructura química no ha sido
determinada.
FORMACIÓN DEL PIGMENTO
 La piel y cartílago contienen una enzima llamada
polifenol oxidasa del ácido homogentísico, la cual
cataliza la oxidación del ácido homogentísico para el
pigmento ocronótico.
 Las polifenol oxidasas son enzimas que catalizan una
reacción que transforma o-difenoles en o-quinonas.
Las o-quinonas son muy reactivas y atacan a una
gran variedad de componentes celulares,
favoreciendo la formación de polímeros negromarrón. Éstos polímeros son los responsables del
oscurecimiento de tejidos.
 Y finalmente conduce a artritis.
ARTRITIS
 La artritis es la inflamación de las articulaciones,
caracterizada por dolor y tumefacción.
 Los síntomas que se presentan de manera
temprana, incluyen cierto grado de limitación en
el movimiento de la cadera, las rodillas y
ocasionalmente los hombros.
 Conforme avanza, puede existir una marcada
limitación en el movimiento.
 Se ha propuesto que el pigmento presente en el
tejido conectivo actúa como un químico irritante
que acelera el proceso degenerativo en el
cartílago.
Otras manifestaciones

Trastornos Cardiacos:
Valvulits Mitral y aórtica
Aneurisma aórtico
Aneurisma del ventrículo izquierdo
Arteriosclerosis en las válvulas cardiacas

Ruptura de discos invertebrales


Prostatitis
Piedras en la próstata



Cálculos renales
Nefrocalcinosis
Nefrosis Ocronótica

Policitemia
UN POCO DE HISTORIA…
1898
1902
• Garrod: Demuestra que la sustancia responsable es HGA
• Garrod: Interpreta la enfermedad como un rasgo autosómico recesivo
• Garrod: Propone que AKU resulta de la perdida de actividad de la enzima
HGO
1908
1958
1992
• Se demuestra la ausencia de la enzima a partir de extracto de hígado, de un
paciente con AKU.
• Se asigna el gen de AKU a la banda 2 del brazo largo del cromosoma 3.
• Fernandez- Cañon y colegas: Trabajaron con el hongo Aspergillus nidulas, lo
que contribuye a la caracterizacion del gen AKU.
1995
1996
• Se busco la proteína homologa en la genoteca de cDNA.
EL AÑO: 1996
 Se identifico un clon + que contenía un gen
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

humano cuyo producto tendría 445 aa y con 52%
de similitud respecto del hongo.
Se demuestra la actividad HGO en E. coli.
El gen se utiliza como una sonda en Northern e
hibrida con un RNA de tamaño esperado.
El clon de c DNA se utilizó para recuperar el gen
completo a partir de una genoteca genómica.
El gen contiene 14 exones y se extiende en un
total de 60 kb.
A-Secuencia Completa de
nucleótidos del inserto de cDNA
 B- secuencia de aa deducidas de HGO A
hmgA.
 C- Northern blot de la expresión de HGA en
los tejidos humanos.
FISH
 Cuando el gen clonado se utilizo para realizar
hibridación in situ, la sonda hibridó con la
banda 3q2, demostrando efectivamente que
se trataba del gen responsable de AKU.
Análisis de mutaciones
frecuentes en dos familias
 Se estudiaron dos familias españolas no




relacionadas: M y S
Se utilizó ADN genómico obtenido de leucocitos
de todos los miembros AKU
Los padres de estas familias no eran
consanguíneos
Los 14 exones del gen HGO fueron amplificados
por PCR y secuenciados para cada miembro AKU
Los datos obtenidos permitieron identificar los
diferentes alelos HGO.
FAMILIA M
 Ambos padres fueron heterocigotos en el locus

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

HGO:
Alelo normal: HGO+
Alelo mutado: HGO p230s. Esta es una mutación
de cambio de sentido (transición 817C>T) que
causa pérdida de función de la enzima
sintetizada.
El alelo HGO es el alelo coheredado en los
enfermos.
Los dos niños de la familia AKU son homocigotas
para este alelo.
FAMILIA S
 Ambos padres son heterocigotos en el locus




HGO.
La madre posee: HGO +/P230S
El padre posee: HGO +/V300G
V300G : transversión en 1028T>G en el exón
12. Generaría una enzima no funcional.
Hijos: 1, 3 y 5 son enfermos (heterocigotas
compuestos); 2 y 6 son sanos (homocigotas
HGO+). El 4 porta un solo alelo mutado
(+/P230S).
CONCLUSIONES
 Solo los individuos afectados heredan dos
alelos mutados HGO: HERENCIA
AUTOSOMICA RECESIVA.
 Los individuos afectados son homocigotas o
heterocigotas compuestos.
 Los dos tipos de mutaciones provocarían
pérdida de función de HGO.
DISCUSIÓN
 AKU es una enfermedad relativamente benigna
y los individuos afectados tienen una expectativa

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

de vida normal.
Durante la infancia son asintomáticos.
Es característico la aparición de HGA en orina.
Pueden sufrir artritis debilitante.
Los daños en el tejido conectivo, se deben a la
deposición de pigmentos ocronóticos.
Como tratamiento: ac. Ascórbico que provoca
inhibición de la polifenol oxidasa, sin afectar la
excreción de homogentisato.
 Es común cálculos es la próstata.
 Se hallaron altos niveles de m RNA de HGO
en la próstata. Lo que sugiere que el
catabolismo de la fenilalanina juega un papel
importante en la fisiología de este órgano.
AVANCES DE LA ALCAPTONURIA
• Miguel A. Pañalva y Santiago Rodríguez de Córdoba de
Madrid, identificaron y caracterizaron el gen humano HGD,
única copia de 54.363 pb.
• transcripto de HGD: 17.715 pb de longitud, 14
exones que oscilan entre 35 y 360 pb.
• proteína HGD: compuesta por 445 aminoácidos.
• El 26% de la secuencia genómica del HGD humano
representa elementos repetitivos
Las mutaciones del gen HGD
 Fernández-Cañón y colaboradores en 1996,
identificaron las dos primeras mutaciones:
 P230S en el exón 10
 V300G que afecta al exón 12
 Hoy en día hay en total 115 mutaciones conocidas de
HGD.
 Se creo una base de datos de mutaciones de HGD en
internet http://hgddatabase.cvtisr.sk/
 Todas las variantes de AKU son descriptas ahora de
acuerdo a la nomenclatura de La Sociedad de Variación
del Genoma Humano.
Prevalencia de mutaciones
Los distintos tipos de mutaciones en el HGD
 Las 23 mutaciones más frecuentes se presentan en 361 de
496 cromosomas de AKU (72,8%)
 hay alrededor de 30 cromosomas de AKU informados en los
cuales no se identificó ninguna mutación en el gen HGD.
Posiblemente llevan mutaciones intrónicas profundas
afectando el empalme.
Puntos críticos de mutación en el gen HGD
 Beltrán-Valero de Bernabé y colaboradores mostraron
que el motivo de la secuencia “CCC” y su complemento
invertido “GGG” son preferentemente mutados
 Son puntos críticos mutacionales en el gen HDG:
> nucleótido c.342+1 G,
> triplete “CCC”,
> los dinucleótidos CpG.
Estructura cristalina de la enzima HGD humana
 La enzima en su forma activa es una proteína hexamérica,
siendo un dímero de trímeros
 El sitio activo está formado por el dominio c-terminal y la
interfaz del trímero, y contiene His292, His335, His365,
His371 y Glu341.
 Las interacciones intersubunidades son importantes para la
actividad de la enzima HGD
 La estructura de HGD puede ser fácilmente alterada por las
mutaciones.
 La mayoría de las enzimas mutantes mostraron una ausencia
total o muy bajos niveles de actividad enzimática
 Grasko y colaboradores informaron de la mutación con
pérdida de sentido K57N
Mutaciones según las consecuencias
estructurales:
1° : Afectan directamente a los residuos del sitio activo
• alterando el cofactor de unión .
2° : Afectan indirectamente al sitio activo
• modificando su conformación.
3° : Interfieren en el plegamiento de la subunidad de HGD
• alterando la estructura hidrofóbica intra-subunidad,
• modificando las interacciones electrostáticas,
• removiendo un aminoácido polar de una posición importante,
• introduciendo un contacto estérico desfavorable.
4° : Afectan interacciones intersubunidades
• dentro del trímero,
• entre trímeros.
5° : Mutaciones que truncan el C-terminal
• su pérdida conduce a la pérdida de interacción y a defectos estructurales
generales.
Diagnóstico de ADN
 Cuando se encuentra una nueva variante se usan varios
programas.
 Vilboux y colaboradores (2009), usaron cinco herramientas
bioinformáticas especialmente diseñadas (SIFT, PANTHER,
PMUT ,POLYPHEN, y SNAP);siendo entre 50% y 80%
exactos
Más confiables (estructura en 3D),pero tienen
limitaciones
 Se utilizó dos herramientas BDGP y NetGene2 para
analizar el potencial efecto de las variantes del sitio de
empalme
 HUMAN SPLICING FINDER:
 predice el efecto de las mutaciones del empalme,
 el análisis de secuencia
 permite una comprobación rápida de la mutación.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
 Se secuencia toda la región codificante, incluyendo las
secuencias intrónicas adyacentes
 Para confirmar el efecto patogénico de una nueva
variante con pérdida de sentido
se recomienda probar si la variante segrega
en la familia y se asocia con la enfermedad
RELACIÓN GENOTIPO-FENOTIPO
 No existe correlación aparente entre el genotipo de un
paciente y el nivel excretado de ácido homogentísico.
 El fenotipo de la enfermedad es causado por mutaciones con
pérdida de función aparentemente parciales.
 La correlación genotipo-fenotipo son complicados cuando
se consideran pacientes con dos mutaciones diferentes
Genética de población de AKU
 Tiene muy baja prevalencia de 1:100.000-250.000 en la mayoría
de los grupos étnicos, y está incrementada en Eslovaquia y la
República Dominicana en el orden de hasta 1:19.000.
AKU en el mundo...
 Se emplean las asociaciones alélicas de los polimorfismos
intragénicos del HGD
 Los haplotipos del HGD son construidos en base a la
segregación en la familia de algunos polimorfismos
 Beltrán-Valero de Bernabé y colaboradores (1998)
mostraron que los pacientes que compartían las mismas
mutaciones -M368V, V300G, o P230S- también compartían el
mismo haplotipo.
 Los haplotipos diferían entre estos pacientes sólo en las
regiones distales a la posición de la mutación.
Mutaciones
El cambio con pérdida de • Europa principalmete y en Finlandia, Francia,
Alemania, Portugal, Eslovaquia, España, Estados
sentido M368V es la
Unidos y el Reino Unido, entre otros.
mutación más frecuente
También hay otras varias
• Finlandia, Eslovaquia, India, Turquía, UAE, Reino Unido,
mutaciones como S59fs
y Estados Unidos, entre otros.
(R58fs)
V300G es una de las
primeras mutaciones de
identificadas
P230S
• Francia, Alemania, la isla de la Reunión, Portugal,
Eslovaquia, España, Estados Unidos y el Reino Unido
• España, Turquía, Eslovaquia, Estados Unidos y las Islas
Canarias.
Otras mutaciones son
• Eslovaquia, República Checa, República Dominicana.
más específicas de
algunos países o regiones
Análisis de Haplotipo
 Usada en países con una incidencia incrementada de AKU
 Siendo identificadas dos mutaciones:
 C120W (14/16), mutación fundadora clásica
 G270R (2/16), es un evento de mutación recurrente
 En Eslovaquia han siendo identificadas un total de 12
mutaciones diferentes
 Es difícil explicar el incremento en la incidencia de AKU en
este país relativamente pequeño por un efecto fundador
clásico.
 La incidencia de esta enfermedad en muchos países puede
que sea mayor de lo pensado.
Especificidades genéticas de la AKU
ESLOVACA
 Revelando una notable heterogeneidad alélica de AKU
 Fue realizada una asociación alélica para:
 11 polimorfismos intragénicos de HGD
 en un total de 69 cromosomas de AKU
 de 32 pedigrees eslovacos.
“para estudiar el posible origen de estas mutaciones”
 El estudio geográfico muestra un notable agrupamiento en
un área pequeña en el noroeste de Eslovaquia.
 Probablemente tuvo incidencia la ruptura del aislamiento
genético en 1950
Análisis y comparación de
haplotipos
 Fueron observadas en Eslovaquia dos grupos de
mutaciones HDG:
 El 1 er grupo:
 P230S, V300G, S59fs (R58fs), M368V e IVS1-1 G>A
 Probablemente introducidas por las poblaciones
fundadoras que se diseminaron por Europa.
 El 2do grupo:
 son las restantes siete mutaciones establecidas más
predominantes G161R (44,2%), D153fs (G152fs)
(14,4%), H371fs (P370fs) (11,5%), y G270R (7,7%),
IVS5+1 G>A, S47L y E178G
 Es probable que se hayan originado en Eslovaquia
 Se a demostrado que las mutaciones que se originaron en
Eslovaquia están asociadas con secuencias hipermutadas en
el HGD
 Es responsable de la alta heterogeneidad génica una
determinada mutación
 El incremento en el número de mutaciones podría ser por:
• La acumulación azarosa de mutaciones en la región
• La colonización Valaquia
 La preservación de las variantes de AKU más predominantes,
pueden ser el resultado de:
• Un efecto fundador y derivaciones genéticas.
GRACIAS POR SU ATENCION!!!!! 
Que tengan un buen viernes!!!!