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ANALYSE DER INOSIN-5'-MONOPHOSPHATDEHYDROGENASE-AKTIVITÄT UND DER IMPDH1GENEXPRESSION IN DEN LYMPHOZYTEN VON
MYCOPHENOLAT-MOFETIL-BEHANDELTEN
NIERENPATIENTEN
6. November 2013
Masterseminar – Marc Müller
Inhalt
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1
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Grundlagen
1.1
Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere
1.2
Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands
1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
1.4
GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen
Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH)
2.1
IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente
2.2
Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung
Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
1 Grundlagen
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1.1
Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere
Quelle: http://www.jameda.de/gesundheits-lexikon/bilder/
1 Grundlagen
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1.1
Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere
Lokalisierung und Besonderheiten:
Knapp unterhalb der Rippenbögen in Höhe des 12. Brustwirbels jeweils rechts und links
Neben der Lunge einziges Organ in doppelter Ausführung
Form einer Bohne mit Einbuchtung in der Mitte
Einmündung der Nierenarterie
Ausmündung der Nierenvene, Lymphgefäße und Harnleiter
physiologische Hauptaufgaben:
Reinigung des Blutes von harnpflichtigen Substanzen: Harnsäure, Harnstoff, toxische Metabolite
(= glomeruläre Filtration)
Regulation des Wasserhaushalts ↔ Blutdruck
Regulation der Elektrolytkonzentrationen
Gluconeogenese
Hormonsynthese → u.a. Erythropoetin, Renin und Calcitriol (Vitamin D)
1 Grundlagen
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1.2
Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands
Exemplarische Nephropathien
diabetische Nephropathie als Folge von Typ I und II - Diabtetes
Glomerulonephritiden / Glomerulopathie (Autoimmunentzündung der Nieren)
Tubulointerstitielle Nierenerkrankungen (bakteriell, viral oder toxisch)
Fehlbildungen der Nierengefäße
Tumore (Nierenzellkrazinom oder Onkozytom)
…
Datenquelle:
1 Grundlagen
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1.2
Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands
Inzidenz:
210 neue Dialysepatienten pro 1 Million Einwohner ( ≈ 16900 bezogen auf deutsche
Gesamtbevölkerung)
GFR = glomeruläre Filtrationsrate
Häufigkeit einer starken Niereninsuffizienz (Stufe 5):
0,13 % der deutschen Gesamtbevölkerung
einer von 1000 Bürgern
Datenquelle:
1 Grundlagen
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1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Dialyse / Blutwäsche
Nierentransplantation
Quelle: Fresenius Medical Care AG
1 Grundlagen
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1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Nierentransplantation
Problematik:
Potenzielle Transplantatabstoßung! → induziert durch Immunantwort beim Transplantat-Empfänger
Gefahr des Misserfolgs der Nierenersatztherapie
Potentielle Lebensgefährdung für den Transplantat-Empfänger
Lösung:
Rejektionsprophylaxe durch eine immunsuppressive medikamentöse Therapie
→ gezielte Down-Regulation des Immunsystems des Transplantat-Empfängers
1 Grundlagen
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1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Wichtige immunsuppressive Medikamente
Azathioprin
Prodrug → Thiopurinmethyltransferase (TPMT) metabolisiert
diese zu 6-Mercaptopurin
6-Mercaptopurin interferiert als atypisches Nukleosid mit der
DNA-/RNA-Synthese
Inhibierung der Proliferation von B- und T-Lymphozyten
1 Grundlagen
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1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Wichtige immunsuppressive Medikamente
Calcineurin-Inhibitoren
z.B. Ciclosporin
Hemmung der Phosphatase Calcineurin
dephosphoryliert und aktiviert den T-Lymphozyten
Transkriptionsfaktor NF-AT (nuclear factor of activated T cells)
Quelle:
C.R.Kissinger et al. (1995). Crystal structures of human
calcineurin and the human FKBP12-FK506-calcineurin
complex.. Nature, 378, 641-644.
1 Grundlagen
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1.3
Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien
Wichtige immunsuppressive Medikamente
Mycophenolat-Mofetil (MMF)
Prodrug
2-Morpholinoethylester der Mycophenolsäure (MPA)
selektiver, nicht-kompetitiver und reversibler Hemmer der InosinmonophosphatDehydrogenase (IMPDH)
Greift in den Guanosinmonophosphat (GMP) – Stoffwechsel von B- und TLymphozyten ein
inaktive Prodrug (MMF)
aktiver immunsuppressiver Metabolit (MPA)
1 Grundlagen
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1.4
GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen
Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie
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Immundiagnostik der Inosin-5'-MonophosphatDehydrogenase (IMPDH)
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2.1
IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente
IMPDH-abhängige Oxidation
von IMP zu XMP
Angriffspunkt für
immunsuppressive MMFTherapie nach einer
Nierentransplantation
Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie
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Immundiagnostik der Inosin-5'-MonophosphatDehydrogenase (IMPDH)
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2.2
Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung
Methodenentwicklung zur quantitativen Analytik der katalytischen Restaktivität des Plasmaenzyms
Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) in peripherem Blut mittels RP-IP-HPLC nach
Hemmung mit dem Immunsuppressivum Mycophenolat
RP-IP-HPLC = reversed-phase ion-pairing high perfomance liquid chromatography
Quelle:chem.uft.uni-bremen.de
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Immundiagnostik der Inosin-5'-MonophosphatDehydrogenase (IMPDH)
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2.2
Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung
Prinzipielle Idee (keine Details! → Betriebsgeheimnis):
Isolation der
Lymphozyten-Fraktion
aus Patienten Vollblut
(Li-Heparin)
Zellaufschluss und
Enzymisolation
durch ein geeignetes
Inkubationsverfahren:
IMPDH-induzierter
Umsatz des Substrats
IMP zum Produkt XMP
Messung der Analyte
mittels RP-IP-HPLC
und Berechnung der
IMPDH-Restaktivität
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Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
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beim Menschen: zwei Gene welche für IMPDHs
codieren (IMPDH-1 u. IMPDH-2)
mehrere Isoformen von IMPDH-1 bekannt
→ alternatives Splicing der mRNA!
Quellen:
Prosise GL, Luecke H (February 2003), Crystal structures of Tritrichomonasfoetus inosine monophosphate dehydrogenase in complex with substrate, cofactor and analogs: a
structural basis for the random-in ordered-out kinetic mechanism
National Human Genome Research Institute
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Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
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Ziel:
Beitrag zur Beantwortung grundlegender Fragen zur Förderung der Verständnisses
hinsichtlich IMPDH-Immundiagnostik
Korrelation der IMPDH-Genexpressionsaktivität und IMPDH-Enzymaktivität
Bezug zwischen Transkriptom und Proteom bei der IMPDH-Immundiagnostik
Inwiefern beeinflusst die MMF-Medikation die IMPDH-Genexpression und -regulation
…
Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
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Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens
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Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
Isolation des
Transkriptoms
(mRNA)
Generierung von
cDNA mittels RT
Amplifikation
von IMPDH-GenTranskripten
durch das Design
geeigneter Primer
Detektion und
Quantifizierung
von IMPDH-GenTranskripten
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