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ANALYSE DER INOSIN-5'-MONOPHOSPHATDEHYDROGENASE-AKTIVITÄT UND DER IMPDH1GENEXPRESSION IN DEN LYMPHOZYTEN VON MYCOPHENOLAT-MOFETIL-BEHANDELTEN NIERENPATIENTEN 6. November 2013 Masterseminar – Marc Müller Inhalt 2 1 2 3 Grundlagen 1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere 1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien 1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen Immundiagnostik der Inosin-5'-Monophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) 2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente 2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens 1 Grundlagen 3 1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere Quelle: http://www.jameda.de/gesundheits-lexikon/bilder/ 1 Grundlagen 4 1.1 Anatomische Grundlagen und Aufgaben der Niere Lokalisierung und Besonderheiten: Knapp unterhalb der Rippenbögen in Höhe des 12. Brustwirbels jeweils rechts und links Neben der Lunge einziges Organ in doppelter Ausführung Form einer Bohne mit Einbuchtung in der Mitte Einmündung der Nierenarterie Ausmündung der Nierenvene, Lymphgefäße und Harnleiter physiologische Hauptaufgaben: Reinigung des Blutes von harnpflichtigen Substanzen: Harnsäure, Harnstoff, toxische Metabolite (= glomeruläre Filtration) Regulation des Wasserhaushalts ↔ Blutdruck Regulation der Elektrolytkonzentrationen Gluconeogenese Hormonsynthese → u.a. Erythropoetin, Renin und Calcitriol (Vitamin D) 1 Grundlagen 5 1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands Exemplarische Nephropathien diabetische Nephropathie als Folge von Typ I und II - Diabtetes Glomerulonephritiden / Glomerulopathie (Autoimmunentzündung der Nieren) Tubulointerstitielle Nierenerkrankungen (bakteriell, viral oder toxisch) Fehlbildungen der Nierengefäße Tumore (Nierenzellkrazinom oder Onkozytom) … Datenquelle: 1 Grundlagen 6 1.2 Einblick in die aktuelle nephrologische Statistik Deutschlands Inzidenz: 210 neue Dialysepatienten pro 1 Million Einwohner ( ≈ 16900 bezogen auf deutsche Gesamtbevölkerung) GFR = glomeruläre Filtrationsrate Häufigkeit einer starken Niereninsuffizienz (Stufe 5): 0,13 % der deutschen Gesamtbevölkerung einer von 1000 Bürgern Datenquelle: 1 Grundlagen 7 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Dialyse / Blutwäsche Nierentransplantation Quelle: Fresenius Medical Care AG 1 Grundlagen 8 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Nierentransplantation Problematik: Potenzielle Transplantatabstoßung! → induziert durch Immunantwort beim Transplantat-Empfänger Gefahr des Misserfolgs der Nierenersatztherapie Potentielle Lebensgefährdung für den Transplantat-Empfänger Lösung: Rejektionsprophylaxe durch eine immunsuppressive medikamentöse Therapie → gezielte Down-Regulation des Immunsystems des Transplantat-Empfängers 1 Grundlagen 9 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Wichtige immunsuppressive Medikamente Azathioprin Prodrug → Thiopurinmethyltransferase (TPMT) metabolisiert diese zu 6-Mercaptopurin 6-Mercaptopurin interferiert als atypisches Nukleosid mit der DNA-/RNA-Synthese Inhibierung der Proliferation von B- und T-Lymphozyten 1 Grundlagen 10 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Wichtige immunsuppressive Medikamente Calcineurin-Inhibitoren z.B. Ciclosporin Hemmung der Phosphatase Calcineurin dephosphoryliert und aktiviert den T-Lymphozyten Transkriptionsfaktor NF-AT (nuclear factor of activated T cells) Quelle: C.R.Kissinger et al. (1995). Crystal structures of human calcineurin and the human FKBP12-FK506-calcineurin complex.. Nature, 378, 641-644. 1 Grundlagen 11 1.3 Nierenersatztherapie bei unheilbaren Nephropathien Wichtige immunsuppressive Medikamente Mycophenolat-Mofetil (MMF) Prodrug 2-Morpholinoethylester der Mycophenolsäure (MPA) selektiver, nicht-kompetitiver und reversibler Hemmer der InosinmonophosphatDehydrogenase (IMPDH) Greift in den Guanosinmonophosphat (GMP) – Stoffwechsel von B- und TLymphozyten ein inaktive Prodrug (MMF) aktiver immunsuppressiver Metabolit (MPA) 1 Grundlagen 12 1.4 GMP-Synthese-Pathway humaner Zellen Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie 2 Immundiagnostik der Inosin-5'-MonophosphatDehydrogenase (IMPDH) 13 2.1 IMPDH als Target immunsuppressiver Medikamente IMPDH-abhängige Oxidation von IMP zu XMP Angriffspunkt für immunsuppressive MMFTherapie nach einer Nierentransplantation Quelle: http://www.uni-koeln.de/medfak/biochemie 2 Immundiagnostik der Inosin-5'-MonophosphatDehydrogenase (IMPDH) 14 2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung Methodenentwicklung zur quantitativen Analytik der katalytischen Restaktivität des Plasmaenzyms Inosinmonophosphat-Dehydrogenase (IMPDH) in peripherem Blut mittels RP-IP-HPLC nach Hemmung mit dem Immunsuppressivum Mycophenolat RP-IP-HPLC = reversed-phase ion-pairing high perfomance liquid chromatography Quelle:chem.uft.uni-bremen.de 2 Immundiagnostik der Inosin-5'-MonophosphatDehydrogenase (IMPDH) 15 2.2 Methodenentwicklung zur IMPDH-Aktivitätsmessung Prinzipielle Idee (keine Details! → Betriebsgeheimnis): Isolation der Lymphozyten-Fraktion aus Patienten Vollblut (Li-Heparin) Zellaufschluss und Enzymisolation durch ein geeignetes Inkubationsverfahren: IMPDH-induzierter Umsatz des Substrats IMP zum Produkt XMP Messung der Analyte mittels RP-IP-HPLC und Berechnung der IMPDH-Restaktivität 3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens 16 beim Menschen: zwei Gene welche für IMPDHs codieren (IMPDH-1 u. IMPDH-2) mehrere Isoformen von IMPDH-1 bekannt → alternatives Splicing der mRNA! Quellen: Prosise GL, Luecke H (February 2003), Crystal structures of Tritrichomonasfoetus inosine monophosphate dehydrogenase in complex with substrate, cofactor and analogs: a structural basis for the random-in ordered-out kinetic mechanism National Human Genome Research Institute 3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens 17 Ziel: Beitrag zur Beantwortung grundlegender Fragen zur Förderung der Verständnisses hinsichtlich IMPDH-Immundiagnostik Korrelation der IMPDH-Genexpressionsaktivität und IMPDH-Enzymaktivität Bezug zwischen Transkriptom und Proteom bei der IMPDH-Immundiagnostik Inwiefern beeinflusst die MMF-Medikation die IMPDH-Genexpression und -regulation … Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion 3 Expressionsanalyse des IMPDH1-Gens 18 Analyse mittels qRT-PCR = quantitativer reverse-Transkriptase Polymerase Kettenreaktion Isolation des Transkriptoms (mRNA) Generierung von cDNA mittels RT Amplifikation von IMPDH-GenTranskripten durch das Design geeigneter Primer Detektion und Quantifizierung von IMPDH-GenTranskripten Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Bei Fragen: fragen!