Transcript HPLC dan Kr. kolom

KROMATOGRAFI KOLOM SEDERHANA
Any
Kromatografi Kolom Sederhana
Bergerak / aliran karena gaya grafitasi
↓
Pemilihan fase diam + fase gerak
↓
Kepolaran
↓
Pita-pita kromatogram
↓
Terbentuk fraksi-fraksi
↓
Dianalisis dengan KLT / KK↓
Pemisahan Secara Kromatografi
Mikhail Tswett
↓
Pigmen tumbuhan
↓
Pita-pita
Pengisian Kolom
Fase diam
Pasir
• fase diam homogen
• fase diam ukuran sama
• fase diam bentuk seragam
• bebas gelembung udara
Kapas / glass
wool
Tehnis : fase diam + pelarut → bubur (fase gerak)
Kolom kromatografi sederhana
(learning kolom)
Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif
CHCl3 : MeOH : H2O = 6,5 :2,5:0,4
Isolat yang diambil
Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan
fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4
Identifikasi kemurnian isolat dengan KLT
CHCl3:MeOH:H2O= 6,5:2,5:0,4
A: isolat hasil isolasi I
B: isolat hasil isolasi II
A
B
Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm.
fase diam = silika GF 254 nm, fase gerak= kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4
Hasil spektra Spektrofotometri UV
Hasil spektra Infra Red
65
40
35
30
25
20
4000
3469.93
%T
45
1636.87
2349.20
2298.27
3500
3000
2500
2000
Wavenumbers (cm-1)
1500
1000
500
454.51
428.60
408.40
50
677.34
603.34
1548.63
55
1125.61
60
Gambar. berbagai metode pemisahan
• Contoh:
11
Klasifikasi Sistem Kromatografi
Umum
Tehnik
Spesifik
1. K. Cair  LLC
(LC)
 LSC
 IEC
2. K. Gas
(GC)
GLC
 GSC
 Gas terikat

Fase diam
Cair pd padatan
Padatan
Resin
Keseimba
ngan
Partisi
Adsorbsi
Tukar ion
Cair pd padatan
Padatan
Padatan
Partisi
Adsorbsi
P/A
SKALA PRIORITAS / DERET ELUOTROPIK
Pelarut
n.Pentana
Iso oktana
Siklo hexana
CCl4
Xylena
Toulena
Benzena
CHCl3
Aseton
Etil asetat
Anilin
Asetonitril
Iso propanol
Etanol
Metanol
Asam asetat
Kekuatan / E0
0
0.01
0.04
0.18
0.26
0.29
0.32
0.40
0.56
0.58
0.62
0.65
0.82
0.88
0.95
besar
Kromatografi
Fase diam
↓
Statinary phase
fase gerak
↓
mobile phase
Pemisahan
↓
Perbedaan laju migrasi
Polaritas senyawa
Hukum Distribusi Kromatografi
↓
perbedaan distribusi komponen di dalam
FG & FD
↓
koefisien distribusi / partisi (K)
↓
K = CS /CM
CS : kons. Molar komponen dlm FD
CM: kons. Molar komponen dlm FG
Secara ideal : CS & CM
↓
kurva linier
CS
Macam-macam bentuk
kesetimbangan CS & CM
CS
0
CM
: ideal → tidak saling campur
→ kromatografi Linier
B/C : ada asosiasi & desosiasi
D : ada reaksi isoterm adsorpsi
Kurva A
D
B
A
C
CM
↓
Kromatografi → cenderung kurva A → konsentrasi relatif rendah
Elusi dalam kolom kromatografi
Solvent
E
B+E
E
kolom
Sp
A+E
E
signal
D
tR
Elusi : proses terbawanya
komponen dlm suatu camp,
shg ada pemisahan
komponen yg dibawa oleh FG
dari ujung atas kolom →
bawah
tR : waktu yg diperlukan oleh
komponen untuk bermigrasi
sepanjang kolom
Vr : volume FG yg
dibutuhkan untuk membawa
komponen dari titik awal
kolom → akhir kolom
F : laju alir FG yang menyatakan jumlah vol FG per satuan waktu
↓
F = VR / tR
tR = VR / F
Dalam kolom yang ideal
↓
Komp. yang tidak teretensi
↓
t=0
↓
Komp. di atas memerlukan waktu untuk bermigrasi →
tM : waktu FG melewati kolom
VM : fraksi volum kolom yang dilalui komponen
→
tR’ = tR – tM
VR’ = VR – VM
terkoreksi
Untuk menerangkan proses pemisahan dlm kromatografi ada
2 macam teori :
1. Teori Lempeng (Plate Theory)
↓
Martin & Synge (1941)
↓
Efisiensi kolom
↓
Apabila jumlah kesetimbangan makin besar
→ efisiensi >> → menambah jumlah lempeng (N)
→ tebal lempeng teoritik → H
N & H → menyatakan efisiensi
↓
Secara matematis : N = L / H
Kelemahan teori :
tidak mampu mengidentifikasi variabel-variabel yang
mempengaruhi pelebaran pita kromatogram
2. Teori Kinetik ( Kinetics Theory)
Dapat mengatasi kelemahan teori Plate.
→ teori laju / rate theory
↓
Partikel komponen bermigrasi diantara FG & FD
↓
Migrasi sangat tidak teratur
↓
Energi thermal
↓
Gerakan partikelnya random
↓
Ditribusi simetrik Gauss
H.E.T.P
H = 16 L x (Wb / tR)2
N = 16 x (tR / Wb)2 = (4tR/W)2
Simetrik Gauss → t (waktu) lama →puncak lebar
Menurut Van Deemter
↓
Ada 3 proses secara stimultan yg mempengaruhi variabilitas laju
migrasi komponen diantara FG & FD :
1.
2.
3.
Difusi Eddy (Eddy diffusion)
Difusi longitudinal (longitudinal diffusion)
Proses transfer massa
↓
Pada tebal lempeng teoritik (H) → merupakan fungsi linier
variabilitas laju migrasi komponen
↓
Persamaan Van Deemter
H = A + B /µ + C.µ
A = koefisien Difusi Eddy
B = koefisien Difusi longitudinal
C = (CS + CM) = koefisien total
Difussi longitudinal
↓
Pelebaran pita
↓
Molekul komponen dlm FG → bermigrasi dari konsentrasi tinggi ke
konsentrasi rendah
↓
Kontribusi variabilitas laju migrasi yg menurun secara hiperbolik
terhadap kenaikan kecepatan linier FG (µ)
↓
Pada tebal lempeng teoritik
HLD =
2ΨDM
µ
B
=
µ
DM = koefisien difusi komponen FG
Ψ = kualitas packing FD
↓
0,6
Pelebaran pita Transfer Massa
↓
Konstribusi H akan naik apabila kec. Linier FG naik
↓
Makin cepat kec. FG akan makin singkat proses transfer
massa → pemisahan rendah
• Pelebaran pita diffuse Eddy
↓
Akibat tidak homogen pori dalam packing kolom
↓
Ada yang jalannya pendek dan ada yang panjang
B
Composite curve
C standar
H. Opt
C mobile
H
H min
A
Proses migrasi
H = A + B / µ + C.µ → Persamaan Van Deemter
Sinyal analitik
tA
tM
0
W
t (waktu)
konsentrasi
Kromatografi camp. 2 komp, yang mengalami retensi & tidak
A
B
Jarak migrasi
Profil konsentrasi komp. A & B dalam kolom pada
jarak migrasi yang berbeda
VARIABEL TERMODINAMIKA PADA PEMISAHAN
Mempengaruhi kualitas kolom
1. Waktu Retensi
V=
tR
tM
xµ
Laju migrasi komponen
2. Faktor-faktor kapasitas kolom (k’)
Ratio jumlah molekul komponen dalam FD
terhadap jumlah molekul komponen dalam FG
Lanjutan…
nS
[ CS x VS ]
k’ =
=
nM [ CM x VM ]
VS
k’ =
xk
VM
k’ =
( tR – tM)
tM
tR ’
=
tM
Pengalaman : k’ < 1
↓
Tidak memisah
Disarankan : k’ semakin besar
↓
Pemisahan ↑
↓
k’ > 10
↓
Tidak ekonomis
3. Faktor selektivitas (α)
↓
Ratio koef. Distribusi 2 komponen yang akan
dipisahkan
↓
Menggambarkan kemampuan pemisahan suatu kolom
↓
α = KB / KA
KB / KA = koef. Distribusi komp. B / A
Dimana : KB = koef. Distribusi komponen B yg teretensi
kuat dalam kolom
KA = koef. Distribusi komponen A yg teretensi
lemah dalam kolom
Ada hubungan dengan k’
↓
α = KB’ / KA’
↓
(tR)B - tM
α=
(tR)A - tM
4. Resolusi Kolom (Rs)
RS=
RS=
ΔZ
=
0,5WA + 0,5WB
2 ΔZ
( WA + WB )
2 [ (tR)B – (tR)A ]
WA + WB
ΔZ = jarak puncak A & puncak B
WA = lebar dasar kromatogram A
WB = lebar dasar kromatogram B
Disarankan RS ≥ 1,5
↓
Hubungan dengan faktor-faktor lain
VN ( α – 1)
k’B
RS =
x
x
α
( 1 + k’B )
4
Sesungguhnya sedekah itu
dapat menghilangkan murka
Alloh & dapat
menghilangkan kematian
yang buruk
(HR. at-Tirmidzi)
33
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
(KCKT)
HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY (HPLC)
Any Guntarti
SKEMA HPLC
Injektor
Kolom analitik
C18
D
Ke penampungan
POMPA
Integrator
Instrumen HPLC
1. Reservoir Fase Gerak
↓
Bisa lebih dari 1
↓
dari gelas / stainless steel
↓
Daya tampung 1- 2 L
Dilengkapi degasser (menghilangkan gas terlarut) → gas
NO2 & O2 → membuat gelembung-gelembung di
dalam kolom & detektor
↓
- Pelebaran pita analit
- Respon detektor terganggu
• Degassing → pompa vakum dihubungkan reservoir &
diaduk / dipanaskan
Solven disaring dengan kertas Millipore
Pemisahan dengan 1 jenis FG dengan konsentrasi konstan
→ Elusi Isokratik
Bila dengan 1 atau lebih FG yang polaritasnya berbeda →
Elusi Gradien
Digunakan FG segar → mendapatkan hasil yang
reprodusibilitas optimum dalam pemisahan
2. Pompa
Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 6000psi)
Kec. Alir 1-3ml/menit
Bahan harus resisten secara kimiawi
Ex : dari teflon & stainless steel
Tidak ada pulsa getaran
Kontinyu
3. Peredam Pulsa Fase Gerak
Ada beberapa detektor sensitive terhadap
variasi kec. Alir FG → ex : index refraksi,
elektrokimia & konduktometer
Peredam aliran dengan gas yang ditekan
4. Sistem Injeksi Sampel
Menentukan presisi perhitungan → reprodusibilitas
sampel
Sampel dimasukkan dengan tekanan tinggi → merupakan
pita dengan sampel tipis → pelebaran diperkecil
Konvensional atau automatik
Injektor Automatik
5. Kolom Kromatografi
Bentuk tabung, permukaan dalam rata
Dari gelas / stainless steel
Lapisan luar kadang dilapisi logam → menahan
tekanan ad 6000 psi, rx kimia dari FG
Sambungan kolom → tidak menyebabkan FG
stagnant
Panjang kolom (10 – 30) cm
Analisis pemisahan cepat (3 – 8) cm
Internal diameter (4 – 5)mm
Partikel diameter (3 – 5) µm
Guard kolom → sebelum kolom analitik
Kolom dari stainless steel
6. Detektor
Pemilihan didasarkan pada problem pemisahan
↓
Harus sensitif (menghindari pelebaran)
Ada 2 macam :
1. Berdasarkan sifat umum larutan
Refraktif indeks → control temperatur
Kurang sensitive
2. Berdasarkan sifat solut/analit/sampel
UV – Vis
Fluorescence
Elektrokimia
↓
Sinyal analit yang berbeda dari FG
↓
Lebih sensitif (µg – ng)
↓
Dikembangkan dengan derivatisasi pre & post kolom
Derivatisasi/modivikasi Instrumen HPLC
50
Alur sampel ke Detektor
7.Interpretasi output dari
Detektor/integrator
• Direkam berupa rangkaian puncak-puncak
• Puncak untuk data kualitatif dan kuantitatif
Profil kromatogram
Dalam gambar, area di bawah puncak Y < dibanding
dengan area dibawah puncak X. Hal ini mungkin
disebabkan :
a.Karena Y lebih sedikit dari X
b.Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih
sedikit
dibanding
dengan
X.
Rangkaian HPLC pada spektrometer massa
Pada saat detektor menunjukkan puncak, beberapa
senyawa sementara melewati detektor dan pada
waktu yang sama dapat dialihkan pada spektrometer
massa. Pengalihan ini akan memberikan pola
fragmentasi yang dapat dibandingkan pada data
komputer dari senyawa yang polanya telah diketahui.
Ini berarti bahwa identifikasi senyawa dalam jumlah
besar dapat ditemukan tanpa harus mengetahui
waktu retensinya.
Fase Normal HPLC
• Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan
pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom
sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm panjang
150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom
akan melekat lebih lama pada silika yang polar
dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh
karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan
lebih cepat melewati kolom.
Fase Balik/Reverse Phase HPLC
Silika dimodifikasi menjadi non polar berupa atom
karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar
digunakan berupa campuran air dan alkohol
seperti metanol.
Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan
bereaksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya
dispersi gaya van der Waals. Molekul-molekul polar akan
bergerak lebih cepat melalui kolom.
Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan
dalam HPLC.
Hasil Analisis dengan menggunakan HPLC