Transcript tt hóa sinh đại cương

BÀI 1: THỰC NGHIỆM VỀ PROTEIN
I. CÁC PHẢN ỨNG MÀU
1. Phản ứng biure
a. Nguyên lý:
Trong mt kiềm, các chất chứa từ hai liên kết peptide
trở lên sẽ tạo phức chất màu tím hồng với Cu++
(muối đồng)
Cơ chế phản ứng:
Protein tạo phức chất màu tím
với đồng trong mt kiềm
b. Ứng dụng


Phát hiện protein
Định lượng protein: Dự vào cường độ
màu tím. So màu: màu càng đậm, càng
nhiều protein.
c. Cách làm
+ è 1: cho khoảng 0,1g ure. Đun trªn ngän löa ®Ìn
cån đến khi ure nãng chảy; ®Ó nguéi sẽ ®îc
biure.
+ è 2: 1 ml lßng tr¾ng trøng
+ è 3: 1 ml dung dÞch gelatin 1%
+ è 4: khoảng 1 ml sữa t¬I
Thªm vµo mçi èng 1 ml NaOH 10%, 1-2 giät CuSO4
1%.
L¾c ®Òu, quan s¸t, so s¸nh vµ giải thích kÕt quả.
2. Phản ứng xantoprotein
a. Nguyên lý:
C¸c protein cã chøa aa m¹ch vßng nh: Phe, Tyr, Trp, vv… díi td cña HNO3 ®Æc, bị nitơ hóa thành màu vàng,nÕu gÆp
m«i trêng kiÒm m¹nh thì dÉn xuÊt nµy sÏ t¹o thµnh muèi cã
màu da cam. Cơ chế phản ứng:
b. Tiến hành
Lấy 3 èng nghiÖm
- èng 1: cho1 ml dd lòng trắng trứng
- èng 2: cho khoảng 1 ml sữa tươi
- èng 3: cho 1 ml dd gelatin 1%
Cho tiếp vµo mçi èng 1 ml HNO3 ®Æc , ®un trªn
®Ìn cån, ®Õn khi xuÊt hiÖn mµu vµng. Sau khi đÓ
nguéi, cho tõ tõ tõng giät NaOH 20% (khoảng 1-2
ml) cho ®Õn khi xuÊt hiÖn mµu vµng da cam.
NhËn xÐt vµ giải thÝch kÕt quả.
c. Ứng dụng
- Ph¸t hiÖn protein trong vËt phÈm
- KiÓm tra chÊt lîng protein
II. CÁC PHẢN ỨNG SA LẮNG PROTEIN
Trong dd, protein ở trạng thái keo bền, nhờ 2 yếu tố:
- Sức đẩy tĩnh điện
- Lớp vỏ thủy hóa
Khi một trong 2 yếu tố trên mất đi, protein sẽ sa lắng.
Lµm mÊt ®iÖn tÝch cña protein b»ng c¸ch :
+ Đưa pH cña dd protein vÒ pH ®¼ng ®iÖn (pHi), khi đó
®a sè c¸c protein ë d¹ng lìng cùc, kh«ng mang ®iÖn tÝch.
+ Thªm NaCl, (NH4)2SO4…: c¸c ion sÏ trung hßa ®iÖn tÝch
cña protein.
Lµm mÊt líp vë thñy hãa b»ng c¸ch :
Thªm c¸c chÊt háo níc nh rîu etylic, tanin…
Hai loại biến tính:
+ ThuËn nghÞch: dd dÞch keo cã thÓ trë l¹i tr¹ng th¸i ban
®Çu sau khi khö t¸c nh©n ®i. Thuéc lo¹i biÕn ®æi nµy
gåm cã c¸c ph/øng: ph/øng diªm tÝch, t¸c dông nhÑ cña
cån, axeton ë nhiÖt ®é thÊp...
+ Kh«ng thuËn nghÞch: protein bÞ biÕn ®æi hoµn toµn,
bÞ hñy ho¹i, mÊt tÝnh hßa tan trong níc. Thuéc lo¹i biÕn
®æi nµy gåm: ph/øng g©y sa l¾ng bëi c¸c muèi kim lo¹i
nÆng, ph/øng cña c¸c alkaloit, acid hoÆc kiÒm m¹nh, ®un
s«i...
1. Phản ứng diêm tích
a. Nguyªn lý
- Diªm tÝch lµ ph¬ng ph¸p dïng c¸c muèi nh: NaCl, (NH4)2SO4...
®Ó kÕt tña protein.
Nguyªn nh©n kÕt tña lµ do c¸c tiÓu phÇn protein bÞ trung hßa
®iÖn tÝch bởi các ion. C¸c protein kh¸c nhau sÏ tña ë những
nång ®é muèi kh¸c nhau. Vì vËy cã thÓ t¸ch riªng c¸c protein ra
khái hçn hîp.
- VD globulin cã KLPT lín h¬n albumin, trong níc globulin tÝch
®iÖn (-) Ýt h¬n albumin, globulin bÞ kÕt tña ë nång ®é amoni
sulfat b¸n b·o hßa, cßn albumin kÕt tña ë nång ®é b·o hßa.
b. TiÕn hµnh
Lấy 2 ống nghiệm:
- èng 1: lÊy 3 ml LTT, 3 ml dd (NH4)2SO4 b·o hßa, l¾c ®Òu
®îc dd b¸n b·o hßa, globulin bÞ sa l¾ng, ®Ó 5 phót, läc
sang è.2.
- èng 2: Cho vào ố2 bét (NH4)2SO4, vừa cho vừa lắc, ®Õn
khi b·o hßa, albumin sẽ sa l¾ng. Để 5 phút. Lọc sang è.3.
- èng 3: thu được sẽ mang thử bằng ph/øng biure.
c. øng dông
KÕt tña b»ng c¸ch nµy c¸c protein kh«ng bÞ biÕn tÝnh
Dïng ph¬ng ph¸p nµy ®Ó chiÕt suÊt c¸c protein ho¹t tÝnh.
2. Sa l¾ng b»ng cån
a. Nguyªn lý
- Protein bÞ kÕt tña b«ng hoÆc vÈn trong dung m«i h/c¬
nh : cån, aceton, eter,... Do protein bÞ mÊt líp vá thñy hãa
- Tña cµng dÔ nÕu cã thªm NaCl.
- KÕt tña b»ng cån cã thÓ lµ kÕt tña thuËn nghÞch nÕu
tiÕn hµnh ë nhiÖt ®é thÊp (00 ®Õn – 150C) vµ tña ®îc t¸ch
khái cån mét c¸ch nhanh chãng.
b. TiÕn hµnh
- èng 1 : cho 1 ml cån 96o
- èng 2: cho 1 ml cån 96o, thªm 1-2 giät NaCl b·o hßa
Cho vµo mçi èng 1 ml dd lßng tr¾ng trøng.
- èng 3: 1ml cån 96o, 1ml dd gelatin 1%.
NhËn xÐt vµ gi/thÝch kÕt quả.
c. øng dông
- Dïng cån s¸t trïng
- Dïng ®Ó t¸ch chiÕt enzyme
3. Sa l¾ng bëi nhiÖt ®é cao
a. Nguyªn lý
- Protein khi bị ®un nãng sÏ bÞ x¸o trén vÒ mÆt cấu truc
ph©n tö, mÊt líp vá thñy hãa nªn mÊt tÝnh hßa tan vµ bÞ
®«ng vãn. HiÖn tîng nµy xảy ra m¹nh ë ®iÓm ®¼ng ®iÖn.
- NÕu sù biÕn tÝnh nµy xảy ra ë pH kh¸c nhau (trong m«i
trêng kiÒm m¹nh, hoÆc acid m¹nh), protein vÉn ë tr¹ng
th¸i tÝch ®iÖn nªn kh«ng bÞ ®«ng vãn mµ ë d¹ng dung
dÞch.
b. TiÕn hµnh
LÊy 5 èng, cho vµo mçi èng 2 ml dd lßng tr¾ng trøng.
+ èng 1: ®un s«i, theo dâi sù kÕt tña.
+ èng 2: thªm 1 giät a. acid 1% ®Ó t¹o ®iÓm ®¼ng ®iÖn, ®un
s«i.
+ èng 3: thªm 0,5 ml a. acid 10%, ®un s«i.
+ èng 4: thªm 0,5 ml NaOH 10%, ®un s«i.
+ èng 5: thªm 0,5 ml a.acid 10%, 3-4 giät NaCl b·o hßa, ®un s«i.
NhËn xÐt vµ giải thÝch kÕt quả.
c. øng dông
- Dïng nhiÖt ®é ®Ó hÊp, sÊy tiÖt trïng…c¸c dông cô.
Bài 2: THỰC NGHIỆM VỀ ENZYME
1. Thuû ph©n tinh bét bëi amylase
a. Nguyªn lý
Tinh bét lµ polysaccharide, gåm nhiÒu đơn vị glucose nối víi nhau
bëi lk  - 1,4 glycoside vµ -1,6 glycoside. TB kh«ng cã nhãm
aldehyde tù do , nên không cho phản ứng tromer dương tính.
Nước bọt có amylase, maltase thủy phân TB cho ra các đường
đơn glucose cho phản ứng tromer dương tính.
b. TiÕn hµnh
- Sóc miÖng b»ng níc cÊt. NgËm mét Ýt níc cÊt khoảng 1-3
phót, khÏ cö ®éng lìi ®Ó trén ®Òu níc bät víi níc cÊt, råi cho
qua phÔu läc vµo èng  được dd chứa amylase.
- Nhá lªn phiÕn sø 2 d·y dd lugol 1% : 1TN, 1 ĐC.
- LÊy 2 èng nghiÖm
+ èng A: cho 3 ml TB 1%, 2 ml dd amylase (èng TN)
+ èng B: cho 3 ml TB 1%, 2 ml níc cÊt (èng ĐC)
L¾c ®Òu hai ống, nhá vài giọt từ ống TN vào 1 lỗ ở dãy TN,
vài giọt từ ống ĐC vào 1 lỗ ở dãy ĐC. Sau khoảng 2 phút lại
nhỏ vào lỗ tiếp theo. Quan s¸t sù ®æi mµu vµ nhËn xÐt.
- PhÇn cßn l¹i cña 2 èng thö b»ng p.ø. Tromer. Nhận xét kÕt
qu¶.
2. Ảnh hëng cña nhiÖt ®é
a. Nguyªn lý
PhÇn lín c¸c enzyme cã ho¹t lùc m¹nh ë th©n nhiÖt. NÕu
nhiÖt ®é qu¸ thÊp thì enzym sÏ ho¹t ®éng rÊt yÕu, ngù¬c l¹i
nÕu nhiÖt ®é cao thì enzyme sÏ bÞ tª liÖt vµ bÞ huû ho¹i.
b. TiÕn hµnh
LÊy 3 èng nghiÖm
+ èng 1: cho 1 ml ddamylase, ng©m vµo chËu níc ®¸ 15’.
+ èng 2: cho 1 ml dd amylase, ®un s«i , ®Ó nguéi
+ èng 3: cho 1 ml ddamylase
Sau ®ã cho mçi èng 1 ml dd tinh bét 1% l¾c ®Òu, ®Ó yªn
trong 5-10’ råi thö b»ng phản øng Tromer hoặc dd lugol 1%.
Quan s¸t mµu cña c¸c èng vµ gi¶i thÝch kÕt quả.
3. T¸c dông ®Æc hiÖu
a. Nguyªn lý
Amylase vµ sucrase lµ 2 enzyme th/ph©n lk glycoside, nhng
amylase chØ th/ph©n lk , 1-4 glycoside cña tinh bét, cßn
sucrase chØ th/ph©n lk , 1-2 glycoside cña sucrose.
b. TiÕn hµnh
LÊy 4 èng nghiÖm
+ èng 1: cho 1 ml dd tinh bét 1%, 1 ml dd amylase
+ èng 2: cho 1 ml dd sucrose 1%, 1 ml dd amylase
+ èng 3: cho 1 ml dd sucrose 1%, 1 ml dd sucrase (men bia)
+ èng 4: cho 1 ml dd tinh bét 1%, 1 ml dd sucrase
L¾c ®Òu råi thö b»ng phản øng Tromer, quan s¸t mµu cña
c¸c èng nghiÖm vµ giải thÝch kÕt quả.
4. Ảnh hëng cña pH
a. Nguyªn lý
Vì cã bản chất protein, nªn enzyme rÊt mÉn cảm víi pH cña mt.
Mçi lo¹i enzyme cã mét pH tèi u trong h®éng, VD pepsin cã ho¹t
lùc m¹nh ë pH 1,5-2,5. pH mt cµng gÇn pH tèi u, tèc ®é pư cµng
cao, nghÜa lµ enzyme hđ cµng m¹nh.
Sù thay ®æi pH dï nhá còng ả/h ®Õn ho¹t ®é cña enzyme, do
ả/h ®Õn tr¹ng th¸i ion hãa cña enzyme.
b. C¸ch tiÕn hµnh
LÊy thËt chÝnh x¸c vµo c¸c èng nghiÖm ®¸nh
sè tõ 1- 8 theo chØ dÉn díi ®©y:
Sè èng
pH (ml)
5,4
1
2
3
4
5
6
7
8
1
5,8
1
6,2
1
6,6
1
6,8
1
7,2
1
7,6
1
8
1
Tinh bét 1%
1 ml
1ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
Amylase
0,5ml
0,5ml
0,5ml
0,5ml
0,5ml
0,5ml
0,5ml
0,5ml
L¾c ®Òu, ®Ó 10’ råi thö b»ng ph/øng Tromer, cho biÕt kÕt qu¶ vµ nhËn xÐt.
Phản ứng Tromer
Nguyên lý
- Đun sôi, quan sát thấy màu sắc biến đổi
Chú ý: Không cho nhiều sulffat đồng