Transcript Mikrobiológiai laboratórium felépítése

A mikrobiológiai laboratórium
felépítése, berendezései (GLP)
A mikrobiológiai laboratórium felépítése
• Mikrobiológiai laboratórium „légzsilip” előtérrel
• Járulékos helyiségek:
 előkészítő,
 mérlegszoba, (táptalaj készítő és tároló )
 mosogató,
 sterilező.
A szűkebben értelmezett mikrobiológiai munka céljára
szolgáló steril övezetet el kell különíteni a már
elszaporodott mikroorganizmusokat tartalmazó edények
és eszközök kezelését szolgáló helyiségektől.
Mikrobiológiai vizsgálatokkal foglalkozó
laboratóriumokban zajló főbb
munkafolyamatok
Táptalaj főzés (és sterilezés)
Mintaelőkészítés
Leoltás
Inkubálás
Kiértékelés
Identifikálás
Sterilezés
Mosogatás
Eszközök sterilezése
Törzsfenntartás
A táptalajkészítés és -tárolás berendezései
• Mérlegek
• Desztilláló berendezés vagy ioncserélő gyantát tartalmazó patron
• Főzőlap, vagy vízfürdő
• Hőmérsékletkompenzációs pH mérő
• Automata adagoló
• Hűtőszekrény
Táptalajok típusai
- eredet (természetes, mesterséges, szintetikus)
•- halmazállapot (szilárd, folyékony, félfolyékony)
•- funkció (általános, szelektív, differenciáló)
Mintaelőkészítés berendezései
• Homogenizáló berendezés:
– régebben un. forgókéses homogenizáló berendezés
– ma már (főleg az élelmiszer-mikrobiológiában) a Stomacher-készülék
alkalmazása az általános
• Rázókeverő
• Fagyasztó
Mintaelőkészítés folyamata
•
•
•
•
•
•
CÉL: összetétele ne változzon meg
minta megfelelő hűtése (4 °C) közvetlenül a mintavételtől egészen a
vizsgálatig.
mintavétel és a vizsgálat ideje között nem telhet el több, mint 24 óra
reprezentatív minta legalább 200 g ill. ml
A szilárd halmazállapotú minta:
– fel kell aprítani és összekeverni.
– az előkészített mintából 10  0,1 g-ot a vizsgálathoz steril Stomachertasakba kell mérni,
– 9-szeres mennyiségű hígítóoldattal kiegészíteni (A hígítófolyadék
hőmérséklete 10-20°C)
– hogenizálni.
A folyékony minta
– a vizsgálati minta kivétele előtt alaposan át kell keverni, majd rövid
ideig állni hagyni, hogy a légbuborékok felszállhassanak.
– Ezt követően a minta, steril pipettával kimért 10 ± 0,1 ml mennyiségéből
el kell készíteni a törzsoldatot (kiindulási hígítás) a szilárd mintáknál
leírtakkal azonos módon.
Az elkészített törzsoldat képezi a további vizsgálathoz az alapot.
A steril munkavégzés berendezései
(biológiai biztonsági szekrények)
Cél: mikrobamentes környezet biztosítása.
A laborban keletkező kis légörvények kivédésére I.- II.- III.-kategóriájú
biológiai biztonsági szekrényeket alkalmazunk.
I.- kategóriájú
biológiai biztonsági
szekrény
II.- kategóriájú biológiai biztonsági szekrény
Lamináris box: A levegő szűrése révén mikrobamentes légteret
biztosít a berendezés munkaterében. Elnevezését a lamináris
(turbulenciamentes) légáramlás megvalósítása alapján nyerte. Előnye,
hogy kis helyigényű, munkatere lehetővé teszi a steril munkát.
HEPA (High efficiency particulate air) szűrő
II. - kategóriájú biológiai biztonsági
szekrény
A
légáramlás
iránya
szerint
megkülönböztetünk függőleges (vertikális)
és vízszintes (horizontális) légáramlású
lamináris boxokat.
III. - kategóriájú biológiai biztonsági
szekrény
•
•
Hermetikusan zárt belső tér
A munkálatok a belső térben rögzített, karhosszúságú
gumikesztyűk segítségével folynak.
•
•
Anyagok bevitele, csak légzáró zsilipen keresztül lehetséges
Az anyagok eltávolítása autoklávon vagy folyékony fertőtlenítőszerrel
töltött merítő tankon át történik.
Alkalmas nagyon
veszélyes fertőző
anyagok kezelésére
Az inkubálás berendezései
• Termosztátok: a mikroorganizmusok tenyésztésére szolgáló, kívánt
hőmérsékletre beállítható szekrények.
• Vízfürdő
• Rázógépek: Főleg aerob mikroorganizmusok tenyésztésénél
használják.
Vízfürdős
változatban,
vagy
légtermosztáttal
egybeépítetten
elterjedten
alkalmazzák
mikroorganizmusok
laboratóriumi léptékű szaporítására.
Automata telepszámláló
• 80%-al csökken a leolvasásra fordított idő
• 600 lemezt olvas le óránként
A sterilezés
Sterilezés módszere
Sterilezés eszköze
Túlnyomásos, telített vízgőzzel
autokláv
Forró levegővel
hőlégsterilizáló
Etilénoxid gázzal
gázsterilizátor
Formaldehides gázzal
gázsterilizátor
Antimikrobiális anyagok oldatában
hidegsterilizátor
Hidrogénperoxid plazmában
Plazmasterilizátor (hőre, nedvességre
érzékeny anyagok, eszközök,
műszerek csíramentesítsére
alkamlmas)
Mechanikus módszerrel
mikrobamentesítő szűrő
UV-fénnyel
UV lámpa
Radioaktív sugárzással
generátorok, gyorsítók
Hőhatás
Kémiai
A sterilezés nedves levegővel I.
• Autoklávok (sterilezés gőzzel, nyomás alatt)
– táptalajok és szennyes (kontaminált) edények gőzzel való
sterilezésére szolgáló eszközök
– A
táptalajok
sterilezésénél
figyelembe
veszzük
azok
alkotóelemeinek hőérzékenységét és tömegét (1000 ml-nél nagyobb
volumenben ne, ne töltsük színültig, kupakokat lazítsuk meg)
– csomagolás nélkül eszközt, anyagot sterilizálni nem szabad
– Az üzemeltetés lépései:
• Vízfeltöltés (desztillált vagy ioncserélt vízzel)
• Felfűtés
• Légtelenítés (levegő eltávolítása a légtelenítő szelepen át-5perc, ha
elérte a 100 °C-ot, ekkor a rakomány még csak 50-60°C-os)
• Hőmérséklet-kiegyenlítés (a rakománybak el kell érnie az előírt 121°C,
vagy 134°C hőmérsékletet)
• Csírátlanítás (1AT – 121°C 30perc, de 15 minimum,, pl táptalajoknál
2AT – 134 °C 10 perc)
• Túlnyomás megszüntetése, szárítás
Az autoklávok csoportosítása
Működés szerint:
Típus szerint:
kézi szabályozású
egyfalú
részben automatikus
kettősfalú
Kivitel szerint:
automatikus
álló helyzetű
fekvő helyzetű
egyoldali
kétoldali (ún. átadós rendszerű)
A sterilezés nedves levegővel II.
Frakcionált sterilezés (tindallozás)
Az Bacillus és Clostridium nemzetségbe tartozó
baktériumok igen nagy ellenállóképességgel rendelkező
endospóráinak elpusztítására szolgál áramló gőzben.
Általában hőérzékeny anyagok és eszközök sterilezésekor
alkalmazzák. A bakteriális endospórák azt a hőkezelést,
amin minden vegetatív baktérium elpusztul, túlélhetik.
Ezért a sterilezendő anyagot vagy eszközt 3 napon át napi
fél órára áramló gőzbe kell helyezni. Az első napon a
hevítés elpusztítja a vegetatív baktériumokat, a további
hőkezelések pedig a spórákból kicsírázó baktériumokat.
A sterilezés nedves levegővel III.
Sterilezés áramló gőzben
A sterilezés áramló gőzben légköri nyomáson 100 °C-on
30 percen át történik.
A behatási időt attól a pillanattól kell számítani, amikor a
sterilezendő eszköz vagy anyag elérte a 100 °C-os
hőmérsékletet.
A sterilezésnek ez a módja végezhető autoklávban
(fúvatás), vagy Koch-fazékban.
Ezt az eljárást kell alkalmazni szénhidrátot vagy ennél
magasabb hőmérsékletre érzékeny anyagot tartalmazó
táptalajok sterilezésekor.
A sterilezés berendezései II.
Hőlégsterilező:
– száraz eszközök (lombikok, Petri-csészék, edények) sterilezésére
kialakított szárítószekrény típusú berendezések
160°C
180 °C
200 °C
Gravitációs
120 perc
60 perc
30perc
Cirkulációs
45 perc
25 perc
• Előkészítés, csomagolás (alumínium
fólia , fémtok), munkatér megtöltése
10 perc
• Felfűtés
• Hőmérséklet kiegyenlítés
• Csírátlanítás
• Lehűtés
Gázégő: a laboratóriumi munka során használt
fémeszközök (oltókacs, oltótű, csipesz)
sterilezésére szolgál.
Sterilezés kémiai módszerekkel
A kémiai anyagok hatás alapján csoportosíthatók:
bakteriosztatikus hatás
baktericid hatás.
A hatás az anyagi minőségen kívül függ a koncentrációtól és a hatóidőtől .
Kémiai sterilezésre csak cid hatású anyagok alkalmasak.
Követelmény:
– hatásuk széles spektrumú legyen,
– emberre, állatra és növényre ártalmatlanok, környezetkímélők,
– könnyen kezelhetőek és gazdaságosak legyenek.
A kémiai sterilezésre használt anyagok:
– folyékony
– gáz halmazállapotúak.
PL: etilén-oxid
Az etilén-dioxid előnye, hogy 500 mg/1 koncentrációban 20 °C-on (hideg
sterilezés) 4-5 óra alatt sterilez, így hőérzékeny eszközök(pl. hőre lágyuló
műanyagok) csíramentesítésére is alkalmas.
Hátránya, hogy az etilén-oxid belélegezve tüdőödémát okoz.
Plazmasterilizáló
A eljárás alacsony, mintegy 464C hőmérsékleten , elektromos erőtér
hatására létrehozott hidrogénperoxid plazma-állapotát alkalmazza alacsony
páratartalmú közegben csíramentesítésre.
A gázalakú plazmát általában az
anyag
negyedik
halmazállapotának
tekintik,
amely
ionfelhőből,
elektronokból
és
semleges atomi részecskékből áll.
Az anyagnak ez a halmazállapota
elektromos erőtér, vagy mágneses
erőtér hatására jön létre. (A
természetes
úton
létrejövő
plazmára példa a jól ismert
természeti jelenség, mely a Föld
északi pólusán észlelhető, az aurora
borealis, azaz az északi fény.)
Az alacsony hőmérsékletű H2O2 plazma aktív szabad gyökei hatékonyan
elpusztítják a vírusokat, baktériumokat, spórákat, steril állapotot hozva létre.
A folyamat végén vízpára és O2 marad vissza, a rakomány száraz, azonnal
használható, illetve a hatékony csomagolás révén szállítható és a kívánt ideig
tárolható.
Sterilezés szűrővel
Folyékony és gáz halmazállapotú anyagok szűréssel is sterilezhetők.
Pórus átmérők:
– bakteriológiában: 0,22-0,65 m között változik
– virológiai laboratóriumok 25-100 nm közötti, ami alkalmassá teszi
ezeket a szűrőket a vírusok nagyság szerinti differenciált visszatartására
(ultraszűrés).
Korábban a szűrőket égetett agyagból, kovaföldből vagy mázatlan
porcelánból készítették, ma már:
– A Seitz-féle szűrők azbesztből préselt korongok, egyszer használatosak.
– Az üvegszűrők szűrőfelülete préselt üveghab vagy üvegszál.
– A membránszűrők cellulóz-észterből készült vékony filterek. Egyszer
használatos szűrők. Előnyük, hogy pórusátmérőjük szabályozható, egyegy szűrőnél valamennyi pórus azonos méretű, a szűrés rajtuk keresztül
gyors, a szűrendő folyadékból keveset adszorbeálnak, felhasználásuk
sokrétű. Kaphatók ipari szűrésre megfelelő méretű és laboratóriumban
használatos formában is (fecskendőre rögzíthető, vákuumszűrésre
alkalmas stb).
A
membránszűrők
segédeszközként
felhasználhatók
kis
baktériumtartalmú folyadékok csíraszámának meghatározásakor is.
Sterilezés UV fénnyel
A nem ionizáló sugárzások közül az. ultraibolya sugárzást használjuk
csíramentesítésre
Az UV-sugárzás teljes spektruma (136-400 nm) károsítja a sejteket, de a
legjobb baktericid (baktériumölő) hatást a 250-280 nm hullámhosszú
sugarakkal érhetjük le, ami főként a DNS-molekulák károsításával
magyarázható.
Az UV (germicid)-lámpákat elterjedten alkalmazzák kórházakban,
laboratóriumokban a légtér és felületek csíramentesítésére.
Alkalmazhatóságának határt szab, hogy hatékonysága a fényforrástól
távolodva négyzetes arányban csökken, áthatolóképessége kicsi, és
hatékonyságát a felületeken található szennyeződések a sugárelnyelés
révén jelentősen csökkentik.
Mindemellett tekintettel kell lenni arra, hogy az UV-sugárzás károsítja a
szemet, és karcinogén hatása van, ezért az UV-lámpa üzemeltetésekor
lehetőség szerint a helyiséget el kell hagyni. Amennyiben erre nincs
mód, UV-fényt szűrő szemüveget kell viselni.
Sterilezés ionizáló sugárzással ()
• A nagy energiájú ionizáló sugárzások közül ipari
méretekben a jó áthatolóképességű, rendszerint kobaltizotópból származó gamma-sugárzást használják
injekciós tűk, fecskendők, kötszerek, gyógyszerek és
egyes élelmiszerek (fűszerek) sterilezésére.
• A gamma-sugárzás előnye, hogy a csomagoláson is
áthatol, hátránya, hogy - mint minden radioaktív sugárzás
- permanens, és minden irányba szóródik, ezért csak
speciális körülmények között alkalmazható.
A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI
A mintavétel és előkészítés eszközei
•Szilárd mintákból: steril szike, olló és csipesz.
•A folyékony minták beméréséhez 10 vagy 20
ml-es steril pipetta
•A mintákat sugárzással sterilezett polietilén
tasakban homogénezzük
A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI
Tenyésztőedények
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Kémcső
Widal-cső
Erlenmeyer-lombik
Álló lombik
Táptalaj üveg
Roux-palack
Petri-csészék
Durham féle
fermentációs cső
A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI
Oltóeszközök
•
•
•
•
•
oltókacs
oltótű,
pipetta
szélesztőbot
automata adagoló pipettákat
A MIKROBIOLÓGIAI MŰVELETEK ESZKÖZEI
A mikroszkópos vizsgálat eszközei
–
–
–
–
–
tárgylemez
fedőlemez
tárgylemez-csipesz
festőkád vagy festőtálca
számlálókamra