Transcript La methode de execution de section fines pour la microscopie

La methode de execution
de section fines pour la
microscopie photonique
La methode de execution de section fines
pour la microscopie photonique
Étapes:
1. Prélèvements de tissus ou des cellules
2. Fixation par des méthodes physiques ou
chimiques
3. Enrobage avec du plastique, des résines,
ou à la paraffine
4. Confection des coupes (microtomie) et
montage sur lame
Matériel d'étude
• Prélèvements cellulaires : étude cytopathologique
• Le recueil de cellules isolées peut constituer :
- un examen de dépistage en l'absence de symptômes, dans une
population particulièrement susceptible d'être atteinte d'une affection
- un examen diagnostique,
- une méthode de suivi post-thérapeutique.
• Il est réalisé :
- par raclage (frottis) d'une muqueuse (col utérin, vagin) ou de la peau
- par ponction d'un liquide normal ou pathologique (liquide
céphalorachidien, sang, ascite, liquide pleural...) examiné après
cytocentrifugation
- par recueil d'un produit de sécrétion, urines, lavage bronchioloalvéolaire, examiné après cytocentrifugation
- par cytoponction à l'aiguille fine, d'un organe plein ou d'un kyste,
parfois de façon dirigée, sous échographie ou scanner
- par apposition sur lame d'un fragment tissulaire avant sa fixation.
Matériel d'étude
Prélèvements tissulaires : étude histopathologique
La biopsie est le prélèvement d'un fragment de tissu chez un être vivant. Elle permet
l'examen d'une partie (biopsie partielle) ou de la totalité (biopsie exérèse) d'une lésion. Elle est
faite :
- sous contrôle de la vue, au bistouri ou avec diverses pinces, en surface ou au cours des
endoscopies (gastrique, bronchique, colique : cœlioscopie...),
- à l'aiguille (ponction-biopsie) dans les organes profonds
La pièce opératoire est le résultat d'un acte chirurgical avec résection d'un ou plusieurs
organes. Son étude comporte un bilan macroscopique des lésions (nombre, siège, aspect), qui
peuvent faire l'objet de photographies macroscopiques, et la réalisation des prélèvements
nécessaires à l'examen microscopique.
L'examen extemporané est une technique rapide qui permet, au cours d'une intervention
chirurgicale, de donner un résultat histologique en moins de 20 minutes. Il s'effectue par
congélation d'un fragment tissulaire, coupe et coloration simplifiée. Il est moins précis que la
technique histopathologique standard, qui doit toujours le compléter, après le délai habituel de
fixation et la procédure de routine. Il est indiqué lorsque son résultat peut modifier l'acte
chirurgical.
L'autopsie (ou nécropsie) est un examen fait chez un patient décédé pour préciser les lésions
responsables des symptômes observés, établir les causes médicales immédiates de la mort et
juger éventuellement de l'effet des traitements appliqués.
Les prélèvements animaux peuvent être l'objet d'une étude anatomo-pathologique, en
médecine vétérinaire ou au cours d'une expérimentation.
Fixation par des méthodes physiques
1.
2.
3.
La dessication est une des méthode la plus simple.
Elle consiste a laisser I’eau s’ évaporer a l’air libre
et a température ambiante.
La sublimation consiste a faire évaporer la glace.
Elle suppose d’abord une transformation de l’eau
en glace par congélation, ensuite une sublimation
de la glace.
Il existe une troisième possibilité qui consiste a
remplacer l’eau par un solvant miscible a I’eau :
alcool éthilique, méthilique, ou l’acétone. Cette
technique s’appelle la déshydratation.
Principe de la substitution,imprégnation,et
enrobage en mode cryogénique
•
•
Dans le cas de l’echantillon congelé, la substitution se fait à basse
température, la glace est progressivement remplaceé par de l’alcool ou de
l’acétone. On ne revient pas a la phase liquide de l’eau pour éviter la
migration des ions et toutes les redistributions qui se produisement dans cet
état. On évite également la transformation de la glace vitreuse en glace
cubique ou hexagonale qui détruit les structures.
Pour que la substitution puisse s’effectuer dans un délai correct, on pratique
cette opération sous l’action du vide (a -90 degrès C). La glace est extraire
par le vide et se dissout dans le solvant; ce dernier ce pénetre peu a peu au
coeur de l’ échantillon. Apres , on augmente régulierement la température
pour assure une totale substitution de la glace.
Principe de la cryo-sublimation
• La tension de vapeur de la glace est liée a la température et a la pression.
Lorsqu’on augmente la témperature, donc la tension de vapeur, on accélère
l’ évaporation de la glace. Il est aussi nécessaire de diminuer la pression pour
obtenir le même effet.
Fixation par des méthodes chymiques
• Pour que les composantes soient préservées, les tissus doit être
traité avec des produits chimiques qui en empêchent la
détérioration. Les produits chimiques employés s'appellent
fixateurs, préparés en solution.
•
La fixation s'effectue:
1. par immersion (en baignant dans le fixateur les pièces des tissus avec des dimensions de 1 mm)
2. par perfusion (en remplaçant par le fixateur le sang de l'animal
anesthésié, par perfusion transcardiaque)
Principe de la fixation chimique
• La fixation chimique consiste a ponter les protéines.
• Il s’ensuit une dénaturation des protéines et une perte de tous les
élements diffusibles de petites dimensions.
• Les fixateurs chimiques s'unissent aux protéines des tissus ou les
dénaturent et les précipitent en remplaçant l'eau qui leur est
associée.
• En dénaturant les protéines, la fixation chimique bloque les
systemes enzimatiques, ce qui empeche toute détérioration
ultérieure du matériaux par autolyse.
• Le fixateur se lie aux protéines par réaction d’addition au niveaux
de doubles liaisons ou de groupements alcool, aldéhyde ou
hydroxyle.
• Les fixateur utilisés sont des aldéhydes (paraformaldéhydes, glutar
aldéhydes) ou des puissants oxydants (tétroxyde d’osmium), seuls
ou en combinaison avec d'autres produits. Certains fixateurs
spéciaux peuvent être employés pour la préservation de
composantes tissulaires spécifiques.
• Les aldéhiyes sont des bons fixateurs des protéines et des acidés
nucléiques.
ENROBAGE
• Il est difficile de couper un organe fixé en tranches suffisamment
minces pour être observables au microscope. Puisqu'un un bloc de
cire peut être tranché très finement. Cette méthode permet d'obtenir
des coupes d'organes aussi minces que 5µm.
•
Comme la paraffine n'est pas miscible avec l'eau contenue dans
l'organe et le fixateur, il faut déshydrater l'organe dans des bains
successivement plus concentrés d'éthanol, puis d'éthanol absolu;
c'est le processus de déshydratation. Puisque l'alcool n'est pas
miscible avec la paraffine, l'organe infiltré d'alcool doit être baigné
dans du dioxane ou du xylène avant d'être placé dans des bains de
paraffine liquide. Dioxane et xylène sont miscibles tant dans l'alcool
que dans la paraffine. Une fois l'enrobage achevé, c'est à dire que
l'organe est infiltré et enrobé de paraffine et le dernier bain de
paraffine est refroidi, on obtient un bloc qui sera facilement débité.
Principe de la déshydratation
• La déshydratation consiste a remplacer progressivement l’eau
par un solvant. Ce dernier doit être a la fois miscible a l’eau et
la rèsine d’inclusion. Parfoi il faudra utiliser deux solvants
successifs, le premier miscible a l’eau et le deuxieme miscible
au premier et a la résine. Ces solvants sont des alcools, de
l’acétone ou des composés aromatiques.
• La déshydratation se fait très progressivement dans des
bains successifs de solvant de plus en plus concentrés. Elle se
termine dans des bains de solvant pur.
Etapes de la technique de déshydratation
• La déshydratation car l’eau et la paraffine ne sont pas
miscibles. Elle doit être progressive, par des alcools à
60, 80, 95 et 100° alcool absolu, afin que les fluides se
substituent les uns aux autres jusqu’à l’imprégnation
dans la paraffine. L’alcool utilisé en technique courante
est l’alcool éthylique. Il peut être dénaturé par du
méthanol ou de l’alcool isopropylique afin de le rendre
impropre à la consommation et de réduire les coûts de
fonctionnement. Il est possible également pour les
premiers postes d’utiliser des alcools recyclés.
•
Un éclaircissement doit être fait par du Xylène,
Toluène ou Méthylcyclohexane (MCH), l’alcool et la
paraffine n’étant pas miscibles. Ce dernier est moins
toxique que le Toluène ou le Xylène.
Principe de l’impregnation
• La qualité des coupes est en grande partie fonction de
l’absence de toute trace de solvant dans la paraffine
de la coupe : ce résultat est obtenu par la pratique des
bains multiples de paraffine, la pièce étant passée dans
au moins 3 bains successifs avant le coulage du bloc.
Ces bains doivent être fréquemment changés car ils se
chargent progressivement de solvants ; le dernier bain
doit toujours être constitué de paraffine vierge. La
persistance de toluène ou de tout autre agent clarifiant
abaisse le point de fusion de la paraffine, rendant donc
celle-ci plus molle et moins propre à la coupe et entraîne
une dessiccation (par évaporation du solvant) et une
rétraction des structures, réalisant l’aspect « cuit »
caractéristique des inclusions défectueuses.
Etapes de la technique de l’imprégnation
• Elle s’effectue dans une paraffine maintenue à l’état
liquide par un séjour dans une étuve dont la température
est réglée légèrement au-dessus de son point de fusion.
Lorsque l’imprégnation est complète, la pièce est retirée
et placée dans un bain de paraffine que l’on fait durcir à
la température du laboratoire : on obtient ainsi un bloc
prêt à être coupé.
• La durée de l’imprégnation varie suivant le volume des
pièces. Elle est en moyenne de 6 heures au total pour
des pièces assez petites, mais est souvent portée sans
inconvénients à 24 heures
La « mise » en blocs
• Une fois les pièces imprégnées de paraffine, il faut les inclure dans
un bloc de paraffine afin de permettre la coupe au microtome. C’est
l’enrobage qui peut se faire manuellement. Pour cela on peut
utiliser, des barres de Leuckhardt, pièces métalliques en forme de L
que l’on pose sur une surface plane et que l’on rapproche plus ou
moins selon la dimension de la pièce.
Le refroidissement de paraffine amène sa solidification en un bloc
prêt à être coupé. Ce refroidissement est généralement obtenu en
laissant reposer la paraffine à la température du laboratoire.
La finition du bloc après refroidissement et démoulage, doit être
retaillé afin de nécessiter un minimum de dégrossissage au
microtome et permettre une coupe plus aisée.
D’autres méthodes d’inclusion
• Inclusion en paraplast (mélange de paraffines purifiées et de
polymères plastiques) qui possède de grandes qualités de résistance
et d’élasticité. L’inclusion des pièces dans ce mélange est conseillé. Il
permet la confection de coupes très fines de tissus durs ou de
consistances différentes, avec des résultats d’excellente qualité.
• Méthode d’inclusion en celloidine Elle permet une imprégnation des
tissus à froid, sans chauffage. Mais c’est une méthode lente sont
Nécessaires (plusieurs semaines).
Sa consistance autorise des coupes de grandes dimensions (utérus,
sein...) et surtout d’encéphale dans les laboratoires de neuropathologie.
• Double inclusion en celloidine et en paraffine. Cette méthode comporte
certains avantages de la célloïdine (maintien correct de tissus durs et de
consistances variées, possibilité de grandes coupes) et de la paraffine
(rapidité, coupes fines).
ENROBAGE
• des barres de Leuckhardt; a
température
ambiante,
paraffine se solidifie
la
CONFECTION DES COUPES (MICROTOMIE)
ET MONTAGE SUR LAME
• Le bloc est placé sur la base d'un microtome, appareil muni d'un
couteau et d'un mécanisme d'avancement de sa base, qui permet
de trancher le bloc à l'épaisseur désirée. Pour des études
histologiques routinières, l'épaisseur des coupes varie entre 10 et
20µm.
• La méthode décrite ci-haut est la plus commune pour étudier
l'histologie générale. Toutefois, il existe d'autres façons de préparer
des coupes histologiques. Par exemple, l'organe, fixé ou non, peut
être congelé dans de la glace sèche ou de l'azote liquide (qui
servent de fixateur) et monté sans enrobage sur un microtome à
congélation, ou cryotome. Ainsi congelé, l'organe est suffisamment
dur pour être coupé finement. Cette technique présente l'avantage
d'obtenir des résultats très rapidement, mais de qualité moindre.
L'enrobage d'une pièce d'organe peut se faire avec du plastique ou
des résines, plutôt qu'à la paraffine, lorsque des coupes de l'ordre
de 1µm ou moins sont désirées.
• Afin de pouvoir être observées au microscope, les coupes obtenues
sont montées sur des lames de verre préalablement recouvertes de
"colle" d'albumine ou de gélatine pour en assurer l'adhérence, puis
sont séchées; c'est le montage sur lame.
Le microtome
Manivelle
Support du bloc de paraffine
Couteau en acier
ruban
pinceau
scalpel
lame
Le microtome
TECHNIQUE
1. reculer le porte objet au maxium
2. placer le bloc dans le porte objet sans
le fixer
3. placer le rasoir face gravée vers
l'extérieur : e fixer (face à couper dans
un plan vertical, paralèle au fil du
rasoir, les deux arêtes du bloc les plus
ongues horizontalement
4. dégrossir à la main
5. régler l'épaisseur des coupes (5
microns)
6. mettre le cliquet
7. couper (à chaque avancée du
couteau,
une coupe est réalisée.L’ensemble
des
coupes forment un ruban
récupéré sur un pinceau).
Etalement des coupes sur la lame
• Les lames gravées et garnies de ruban de paraffine sont
disposées sur une platine chauffante
• Les coupes sont placées dans une étuve dont la température est
légèrement inférieure au point de fusion de la paraffine, pendant au
moins 30 minutes. Si le tissu est particulièrement fragile, les coupes
sont séchées dans une étuve à 37° pendant toute une nuit. Les coupes
peuvent alors être colorées.