Transcript Cytologie - Inclusion

La cytologie
Elle concernent
·
les étalements, frottis et smears (écrasement et étalement de tumeur
par exemple pour obtenir un couche monocellulaire) qui seront fixeés par
des fixateurs déshydratants spray ou bain d’alcool.
Ces techniques ne donnent pas accès à l'intérieur des cellules
·
Les liquides, urines, cytoponctions qui seront cytocentrifugés pour
projeter le matériel cellulaire sur une lame de verre. Ces lames sont
ensuite fixées par fixateurs déshydratants.
On peut avoir besoin d’étudier des coupes de culot cellulaire
(immunomarquage de l’intérieur de cellules isolées) on réalise, par
centrifugation alors un culot de cellules fixées au formol ou au
paraformaldéhyde. Ce culot est ensuite préenrobé en gélose puis inclus et
traité comme une petite biopsie.
La circulation
Au cours de cette étape on remplace progressivement le milieu aqueux
cellulaire par le milieu d’inclusion (ou d'imprégnation ).
Le milieu d'inclusion le plus utilisé, en histologie, est la paraffine, on peut
également utiliser certaines résine acrylique.
Ces milieux sont hydrophobes, le milieu d'enrobage ne pourra pas pénétrer
dans le tissu très hydraté. Il faudra faire subir un certain nombre de
traitements à l'échantillon avant de pouvoir obtenir une coupe correcte et
notamment le faire passer dans plusieurs bains de solvants intermédiaires
miscibles à la fois à l'eau et au milieu d'inclusion au cours de la circulation
La circulation peut être réalisée manuellement mais si on a un grand nombre
de prélèvements a traité, on utilise un automate de circulation qui fait
passer les échantillons dans les différents bains. Toutes ces étapes sont
réalisées avec une agitation constante pour permettre un mélange plus
homogène des liquides et une meilleurs pénétration des liquides. Après le
bain de formol le processus se déroule sous vide (élimination de l'air =>
meilleure pénétration)
Le premier bain est un bain de formol, ensuite commence la déshydratation.
La déshydratation:
C'est la première étape de la circulation, elle consiste à retirer l'eau du
prélèvement et à la remplacer par l'agent déshydratant.
Les agents déshydratants:
L'idéal serait d'utiliser un agent miscible à l'eau et à la paraffine ce qui
n'est pas réalisable en pratique. (ex dioxyde d'éthylène cher très toxique
très inflammable)
Le plus utilisé en histologie:
Ethanol C2H5OH
Il provoque un durcissement important et n'est pas miscible à la
paraffine, on doit compléter son action par un autre solvant intermédiaire
Peu toxique il est inflammable et volatil
Acétone CH3CHO
Permet une déshydratation plus rapide mais provoque un durcissement
important. Il est utilisé lors d’une inclusion avec certaines résines
Alcool isopropylique CH3CHOHCH3
plus lent et plus tolérant que l'acétone il rétracte moins les tissus
Procédure de déshydratation:
Le tissu est d'abord transféré dans un bain à 95% d'alcool, un passage
direct dans l'alcool pur entraînerait une grande distorsion des
structures.
Suivi de 2 autres bains alcool à 95%
Puis 3 bains à100% afin d’éliminer le mieux possible l’eau du milieu
cellulaire.
Problèmes engendrés par une mauvaise déshydratation:
Déshydratation prolongée
=>
durcissement excessif
Déshydratation insuffisante =>
la paraffine ne pénètre pas de
manière homogène. On aura des difficultés de coupes ( vibrations
arrachages)
Avec le temps et l’évaporation, le bloc se rétracte on aura des
structures déformées entraînant des difficultés d’interprétation
Éclaircissement
L’agent déshydratant est remplacé par un agent miscible à celui-ci et
à la paraffine au cours de la procédure d’éclaicissement. Ces solvants
ont un indice de réfraction proche de celui des protéines et le tissu
devient transparent d’où leur nom d’agent éclaicissants.
Les agents éclaircissant
Les plus connus sont les hydrocarbures aromatiques
Agent éclaircissants.
Hydrocarbures aromatiques
Benzène
Toluène
CH3
Xylène
CH3
CH3
Produits très toxiques
On utilise plutôt des composés aliphatiques type
HISTOSOL contiennent des solvants organiques et
Cl Cl
C=C
Cl Cl
Problèmes engendrés par un mauvais éclaircissement
Un éclaircissement mal conduit entraînera des effets similaires à ceux
d’une mauvaise déshydratation
C\ Imprégnation
Le milieu le plus utilisé est la paraffine et ses dérivés, peu coûteux et
d’emploi facile
le dernier bain de circulation est un bain de paraffine chaude miscible
à l’agent éclaircissant.
On peut traiter de manière standardisée un très grand nombre de
pièces dans un laps de temps court. La paraffine permet une très
bonne conservation des tissus en blocs solidifiés. La coupe et la
coloration se font très facilement.
le dernier bain de circulation est donc un bain de paraffine liquide (le
point de fusion du milieu varie de 50 à 60°C selon le type de
paraffine).
La circulation
Échantillon
fixé
Non
H2 O
compatible
Imprégnation
paraffine
Compatible
Non compatible
ETHANOL
Compatible
Compatible
HISTOSOL
Résumé : Du prélèvement à la coupe
biopsie
congélation
Organe
grosse pièce
échantillonnage
frottis
liquide
Fixation formol
Préenrobage
gélose
coupe
Cyto
centrifugation
Fixation
Choix du fixateur
Fixation
acétone
Inclusion
paraffine
coupe
Fixation
alcool