Г.И.Филипенко Методы ex situ сохранения генетических
Download
Report
Transcript Г.И.Филипенко Методы ex situ сохранения генетических
Методы ex situ сохранения генетических
ресурсов растений
[email protected]
http://www.cbd.int/
Конвенция о биологическом
разнообразии – первое глобальное
соглашение по сохранению и
устойчивому использованию
биологического разнообразия
http://ruschm.org
• Конвенция вступила в силу 29 декабря 1993 года, через восемнадцать
месяцев после того, как на Конференции ООН по окружающей среде и
развитию, прошедшей в 1992 году в Рио-де-Жанейро, она была
открыта для подписания.
• Более 150 правительств подписали этот документ сразу после
вступления его в силу, а к настоящему моменту Конвенция
ратифицирована 188 странами. Россия подписала Конвенцию в 1995 г.
Сохранение биологического разнообразия
• «Сохранение ex-situ» означает
сохранение компонентов
биологического разнообразия
вне их естественных мест
обитания.
• «Сохранение in-situ»
означает сохранение
экосистем и естественных
мест обитания, а также
поддержание и
восстановление
жизнеспособных популяций
видов в их естественной
среде, а применительно к
одомашненным или
культивируемым видам - в
той среде, в которой они
приобрели свои
отличительные признаки.
Ex situ: плюсы и минусы
Сосредоточенность
растительного разнообразия как
исходного материала в одном
месте, в искусственно
контролируемых условиях.
Относительная безопасность и
гарантия сохранения.
Возможность последовательного
и целенаправленного
изучения, а также –
ускоренного использования в
селекции.
Оперативная доступность для
пользователя.
Централизованное управление,
возможность обработки данных,
создание единой БД.
Возможность постоянного учета
и контроля за продвижением
материала.
Cохраняются лишь
отдельные фрагменты
популяций: отдельные
растения, семена, ДНК, пыльца
или вегетативные части
растений.
Состав коллекции
постепенно обедняется в связи
с постоянным пересевом и
механическими потерями.
Содержание коллекций и их
поддержание в живом виде
связано с большими
финансовыми затратами.
Наличие штата научных
сотрудников и технического
персонала для работы с
коллекцией и необходимость
их профессиональной
подготовки
Ex situ хранение генетических ресурсов растений
Контролируемые
условия
Неконтролируемые
условия
Низкотемпературное хранение
семян
(+4°С; –10°С ; –18°С)
Полевые коллекции
Криоконсервация вегетативно
размножаемых культур
In vitro коллекции вегетативно
размножаемых культур
Хранение семян в лабораторных
условиях
Ультрасухие семена
Организация генетических банков
растений
США - 1958 г.
Япония - 1976 г.
СССР - 1976 г.
Турция – 1978 г.
Скандинавские страны -1978 г.
5 основных генбанков мира (FAO, 2009)
1750 генбанков мира сохраняют
7,03 млн. образцов
(FAO, 2009)
Мировые ex situ коллекции 10 экономически значимых
культур (FAO, 2009)
КУЛЬТУРЫ
ЧИСЛО ОБРАЗЦОВ
1.
Пшеница
857940
2.
Рис
773847
3.
Кукуруза
327931
4.
Фасоль (бобы)
262369
5.
Сорго
235711
6.
Соя
229947
7.
Овес
148260
8.
Арахис
128461
9.
Картофель
99253
10.
Горох
93977
КОЛЛЕКЦИИ СТРАН СНГ
Страна
РОССИЯ (ВИР)
УКРАИНА
УЗБЕКИСТАН
Число образцов
324 000 (54,1%)
130 000 (21,7%)
55 000 (9,2%)
КАЗАХСТАН
БЕЛАРУСЬ
ГРУЗИЯ
35 000 (5,8%)
32 000 (5,3%)
7 000 (1,1%)
АРМЕНИЯ
МОЛДОВА
КИРГИЗИЯ
5 000 (0,9%)
5 000 (0,9%)
3 000 (0,5%)
ТАДЖИКИСТАН
ВСЕГО
3 000 (0,5%)
598 000
Svalbard Global
Seed Vault
Отправка образцов коллекции ВИР в
хранилище на Шпицбергене в 2008-2011 гг.
10 марта 2010 года число образцов,
поступивших из 27 генбанков,
превысило 500 000
Бобы
Вигна
Горох
260
30
48
Кукуруза
Маш
Люпин
989
150
24
Нут
Овес
Сорго
71
210
257
Рапс
Рожь
Мягкая яровая
пшеница
Твердая пшеница
Фасоль
Чечевица
обыкновенная
Чина
Ячмень
Всего
100
93
847
51
81
139
9
803
4162
Nelumbo nucifera Gaerth.
На дне высохшего озера в
Маньчжурии были найдены семена
индийского лотоса, пролежавшие там,
как предполагалось сначала, 160 лет
(Ohga I., 1926)
Позже при помощи метода
определения распада радиоактивного
углерода было показано, что возраст
этих семян 1040±210 лет (Libby W.F.,
1951)
В1954 году в северо-западной части
Канады при археологических раскопках
на плато Юкон в толще промерзшего ила
были обнаружены семена люпина
арктического . Ученые определили, что
им 10 000 лет. Семена прорастили в 1966
году, шесть проросли, дали всходы, и из
них выросли здоровые растения (Porsild
A.E., Harington C.R., 1967)
В 1990-2001 гг. при исследовании лессово-ледовых отложений приморских
низменностей севера Якутии, относимых к эпохе позднего плейстоцена, неоднократно
встречались погребенные норы грызунов, содержащие плоды и семена растений. Их
численность в отдельных норах достигала 600-800 тысяч штук.
Использование метода культуры тканей для анализа жизнеспособности семян
из нор грызунов, погребенных в вечномерзлотных толщах
Вид растений
Сем. Осоковых
Возраст
семян
32800±400
Смолевка
32800±400
Костянка
27700±300
Горец
31800±300
Полученный результат
Разрастание семядоли у единичного
семени
Индукция
начальной
стадии
прорастания зародышевого корешка
и каллусообразование на основе
полученных клеток корня
Активация
роста
зародышевого
корешка
Развитие до стадии образования
семядольных листьев у единичного
семени
П. Беккерель исследовал жизнеспособность семян,
полученных им из хранилищ парижского Национального
музея. Семена были собраны в период с 1819 г. по 1853 г., а
способность их к прорастанию изучалась в 1906 г. и затем в
1934 г.
Для 13 видов П.Беккерель
установил длительность
жизни, равную 55-158 г.г., а
для ряда видов семейства
бобовых - около 200 лет
(Becquerel P., 1932, 1934)
Astragalus
massiliensis Lam.
Cassia bicapsularis L.
Классификация семян по долголетию
• Микробиотики ( меньше 3 лет)
• Мезобиотики (3-15 лет)
• Макробиотики ( больше 15
лет)
Ewart A.J. On the longevity of seeds.
Proc. Roy. Soc, Victoria. 1908. 21, 1210
Ewart, Alfred J. (1872 - 1937)
Макробиотики
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Бобы
Вика
Вигна
Горох
Лен
Нут
Мягкая
пшеница
Овес
Просо
Свекла
Твердая
пшеница
Хлопок
Чечевица
Эгилопс
Ячмень
Мезобиотики
Горчица
Кукуруза
Кунжут
Подсолнечник
Рожь
Редкие виды пшениц
Тритикале
Фасоль
Микробиотики
Гречиха
Кабачки
Лук
Рис
Соя
Примеры долголетия семян в опытах лаборатории
семеноведения ВИР
Культура
Гречиха
Соя
Кукуруза
Бобы
Лен
Просо
Пшеница
Ячмень
Срок хранения
39
40
54
42
37
40
65
54
Всхожесть
40
24
95
99
99
95
22
78
Условия хранения, влияющие на долголетие семян
• Температура
• Влажность
• Парциальное давление кислорода
Снижение температуры на каждые 5° увеличивает продолжительность
жизни семян примерно в два раза . Это правило верно в пределах 0 до
50 °С (Леман Е., Айхеле Ф., 1936, HurringtonJ,F., 1963)
Температуры ниже нуля
благоприятно сказываются на
сохранении
жизнеспособности семенами,
если их влажность не
настолько велика, чтобы в них
произошло повреждение
клеток и тканей от
промерзания (Von Sengbush,
1955)
Увеличение влажности на 1% в интервале от 5 до 15%
укорачивает вдвое период их жизнеспособности
(Hurrington J.F., 1963)
Величины критической влажности зерна и
семян различных культур (%):
гороха, фасоли, чечевицы - 15...16
пшеницы, ржи, ячменя - 14,5...15,5
кукурузы, пpoca, сорго, столовой свеклы 12,5...14
томатов – 11,5…12,5
подсолнечника (среднемасличного),
моркови - 10...11
огурцов - 9,5...10,5
капусты – 9…10
подсолнечника (высокомасличного) – 0…8
• Рекальцитрантные семена содержат большое количество
влаги, их нельзя высушивать при хранении ниже
определенного уровня, который у них довольно высок. К
рекальцитрантным относят семена древесных,
тропических, цитрусовых и некоторых других видов
растений.
• Ортодоксальные семена можно высушивать до низкого
уровня влажности -5% и даже ниже. К ним относятся
семена подавляющего большинства культурных видов
растений (Hong T.D., Ellis R.H.,1996)
Влияние длительного хранения семян пшеницы
сорта Диамант на их всхожесть
Всхожесть,%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Исходная всхожесть
99, исходная
влажность 7,1
Исходная всхожесть
94, исходная
влажность 7,1
Исходная всхожесть
99, исходная
влажность 5,0
0 10 15 20 25 30•
Число лет хранения
Хранение семян в условиях контролируемой
температуры и влажности показало, что увеличение
парциального давления кислорода с 0 до 21% ведет к
снижению всхожести. Дальнейшее его увеличение
практически никакого действия не оказывает ( Abdalla
F.H., Roberts E.H., 1968)
В долговременных опытах по хранению лука
и салата было показано, что семена лучше
сохраняют жизнеспособность в ампулах с
углекислым газом, чем с кислородом
(Harrington B.J., 1966)
Другие факторы, влияющие на
жизнеспособность семян при хранении
•
•
•
•
•
•
•
•
Всхожесть
Наследственные факторы
Матрикальная разнокачественность
Фазы спелости
Место выращивания
Болезни и вредители
Фумигация
Механические повреждения
Генетические изменения в семенах при
длительном хранении
Cемена Oenotera lamarkiana L.
хранившиеся в течение пяти лет,
дали значительно больше
фенотипических вариантов, чем
семена, хранившиеся в течение
одного года (DeVries, 1901).
Аналогичные результаты получил в 1931 году
Н.Г.Нильссон, работавший с тем же видом
(Nilsson N.H., 1931).
В 1933 году М.С.Навашин, исследовавший семена
скерды (Сrepis tectorum L.), обнаружил, что только
0,1% проростков свежих семян имели в корнях
клетки с хромосомными транслокациями, в то время
как после 7 лет хранения число таких растений
возросло до 81%.
Ф.Х.Пето, изучавший семена кукурузы (Zea
mays L.), также наблюдал возрастание частоты
хромосомных аберраций в кончиках корней
проростков длительно хранившихся семян
(Peto F.H., 1933)
В настоящее время в
генетических банках
растений коллекции
принято подразделять на
три типа
• Базовые
• Активные
• Дублетные
• Как правило, семена из базовых коллекций не предоставляют
непосредственно пользователям. Материал из них берут только для
восстановления образца, когда жизнеспособность семян снижается
ниже допустимого уровня, или когда образец не может быть получен
ни из какого другого источника. Базовая коллекция – “золотой фонд”
генетического банка растений.
• Активные коллекции содержат образцы, которые служат для
восстановления, размножения, рассылки, изучения и т.д.
• Дублетные коллекции представляют собой дублетные образцы
базовой коллекции, которые хранят отдельно от нее, чтобы увеличить
надежность хранения.
• Термины “базовая” или “активная” коллекция не
являются синонимами условий хранения образцов. Однако
обычно базовые коллекции хранят в условиях,
обеспечивающих их длительное хранение (long – term
conservation).
• Активные коллекции хранят в более мягких условиях, что
связано, в основном, с экономическими причинами и,
отчасти, с удобством пользования. Такие условия
обеспечивают среднесрочное хранение коллекций
(medium – term conservation)- обычно не менее 10-20 лет.
Условия хранения базовых
коллекций
Условия хранения активных
коллекций
Допустимо: Температура ниже 0
(<0 °C) и 3-7% влажность семян (в
зависимости от вида).
Предпочтительно: -18 ° C или
ниже и 3-7% влажность семян (в
зависимости от вида).
Активные коллекции могут
храниться в условиях, которые
позволяют сохранять
жизнеспособность образцов
на уровне не менее 65% в
течение 10 – 20 лет
Состав коллекции ВИР
Отдел ГРР
Число
образцов
Пшениц
Овса, ржи и ячменя
Крупяных культур
Масличных и прядильных
культур
Многолетних кормовых культур
Зерновых бобовых культур
Овощных и бахчевых культур
Плодовых культур
Картофеля
Всего
51662
36509
48358
27471
30489
45845
50138
23734
9647
323853
64 ботанических семейства, 376 родов, 2169 видов
С целью сохранения базовой коллекции в
1976 году на Кубанской опытной станции
ВИР было построено Национальное
хранилище семян.
Оно представляет собой трехэтажное
здание, в котором два этажа находятся
под землей. На этих этажах расположены
24 камеры для хранения семян.
Каждая камера может вмещать 15-
20 тысяч образцов в зависимости
от размера контейнеров.
Количество образцов коллекции ВИР, сохраняемых
при разных температурных режимах в
«Кубанском генетическом банке семян»
Тип коллекции
Базовая
Дублетная
Активная
Температура,
°С
4,5
-18
4,5
-18
4,5
-18
Итого
Количество
образцов
184320
4092
51923
374
12835
1367
254911
Снижение всхожести образцов коллекции ВИР в процессе
длительного хранения в «Кубанском генетическом банке семян»
Группа культур
Количество образцов, шт.
Доля образцов,
нуждающихся в
пересеве, %%
заложено
требует
пересева
Зерновые и
крупяные
29997
1046
3,5
Просовидные
10800
217
2,0
Зернобобовые
4534
379
8,4
Овощные и
бахчевые
6042
269
4,5
Масличные и
технические
2220
194
8,7
Кормовые
5625
314
5,6
59218
2419
4,0
Итого
Данные по проращиванию образцов семян в 2005-2009 г.г. Образцы были
заложены на хранение в 1976-1994 г.г.
В 2000 г. в Санкт-Петербурге в
зданиях ВИР были введены в
строй новые
низкотемпературные
хранилища
Основные сведения о новых низкотемпературных
хранилищах ВИР
№ Тип
коллекции
Характеристика
хранящихся
образцов
Объем,
м³
Температура, º С
Число
контейнеров
1
базовая
все
334
-10
2184
2
активная
50
-10
336
3
активная
Микробиотики,
перекрестноопыляемые,
редкие, трудные в
размножении
50
-10
336
4
активная
218,5
4
1488
5
активная
218,5
4
1488
Макробиотики,
мезобиотики
Лаборатория длительного хранения семян
является членом ISTA
• International Rules for Seed Testing, 2010
•ISTA Working Sheets on Tetrasolium Testing, 2003
•ГОСТ 12038-84 Методы определения всхожести
•ГОСТ 12041-82 Методы определения влажности.
Подсушивание семян перед закладкой на
хранение в сушильной камере при 20°C и
12%-й относительной влажности воздуха до
3-7%-й влажности семян (в зависимости от
вида)
Упаковка: фольговые
ламинированные
пакеты и стеклянные
бутылочки
Примеры динамики
подсушивания семян в
сушилках ВИР
Низкотемпературное хранение образцов семян мировой
коллекции ВИР в центре (на 1.10.2011 г.)
Отдел ГРР
Базовая
коллекция
-10° С
7894
-10° С
4° С
7469
13461
10489
9176
13562
Зерновых бобовых
6229
7165
7845
13187
25630
31007
Овощных и бахчевых
9597
11065
18205
Масличных и прядильных культур
7345
15154
14526
Многолетних кормовых культур
7041
16162
5810
2314
403
-
Плодовых культур
713
221
ЛДХГР
864
-
57558
82775
Пшениц
Овса, ржи, ячменя
Крупяных культур
Картофеля
Активная коллекция
-
Всего
122201
В общей сложности на хранении находятся 262534 образца
В 2004 г. в ВИР введен в строй криокомплекс
КРИОХРАНЕНИЕ – ПЕРЕДОВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ
РАСТИТЕЛЬНЫХ РЕСУРСОВ
РАСТИТЕЛЬНЫЕ
ОБЪЕКТЫ
Семена
АКТУАЛЬНОСТЬ
ПРИМЕНЕНИЯ
Актуально для семян
редких видов
МЕТОДЫ
КРИОСОХРАНЕНИЯ
Неконтролируемое
замораживание
Неконтролируемое
замораживание
Пыльца
Вегетативные почки
Нет другой
альтернативы
Нет другой
альтернативы
Ступенчатое
замораживание
Витрификация
Инкапсуляция
Культура тканей и
органов in vitro
Нет другой
альтернативы
Криоконсервация плодовых растений в ВИР
Отработаны методики
криоконсервации
•
•
•
почек яблони (P.Forsline,1998)
пыльцы большинства плодовых и
ягодных культур
семян диких видов яблони, груши,
вишни, красной и черной смородины,
крыжовника, малины,
ежевики
Идет разработка и модификация
методик криоконсервации
• черенков и почек
груши,
жимолости синей,
крыжовника,
смородины черной,
черемухи
Идет закладка на длительное хранение в
парах жидкого азота
Почек и черенков яблони, груши, крыжовника,
черемухи, черной смородины
пыльцы большинства плодовых и ягодных культур
семян диких видов яблони, груши, вишни, красной
и чернойсмородины, крыжовника, малины,
ежевики
Криоконсервация пыльцы плодовых культур
•Пыльцу, подсушенную в комнатных условиях в течение 2-3дней, закладывают в
азот прямым погружением.
• Жизнеспособность определяют посевом на питательную среду (сахароза 10-20% +
0,5% агар-агар), с последующим подсчетом проросших пыльцевых зерен под
микроскопом в 3-хкратной повторности.
Влияние криоконсервации на жизнеспособность
пыльцы яблони
Сорт
Жизнеспособность, %
исходная
после хранения
при-196 º С
Ароматное
48,0 ± 1,0
39,1 ± 0,7
Боровинка
56,0 ± 1,3
48,4 ± 3,2
Вкусная
40,7 ± 2,6
59,9 ± 3,3
Июньское
Петрова
20,7 ±1,8
17,6 ± 1,9
Ранетка
консервная
41,7 ± 1,3
36,6 ± 1,7
Процент завязывания ягод сортов черной смородины Risager,
Белоплодная и Лазурь при опылении пыльцой, хранившейся при 186°С ,
составил 94,3-100%.
Методика криоконсервации семян диких видов яблони, груши, красной
смородины и крыжовника
•Подсушивание семян до влажности 5-6 %, быстрое замораживание путем прямого
погружения пробирок с семенами в жидкий азот и оттаивание их при комнатной
температуре.
Определение жизнеспособности семян плодовых
культур тетразольно-топографическим методом
Влияние криоконсервации семян яблони
на их жизнеспособность
100
80
60
40
Динамика прорастания семян яблони после
низкотемпературного и криохранения
20
0
Суммарная доля проклюнувшихся
семян, %
100
M. baccata
var.sibirica
96,0
90,4
79,5
80
M. floribunda
var.Nikita
исходная
72,0
60
M. baccata
49,3
46,0
40
Malus
purpurea
M.sargentii
M. soulardii
M. cerasifera M. orientalis
после криоконсервации
100
96,0
34,0
31,5
89,9
80
20
16,4
0
16,0
0,0
0,0
0
10
20
30
60
40
50
60
70
80
90
M. cerasifera
54,0
100
48,5
40
34,0
26,0
100
96,0
20
79,5
80
0
M. purperea
49,3
46,0
40
34,0
31,5
20
16,4
0,0
0,0
0
0
16,0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
4,0
0,0
0
72,0
60
28,3
18,2
90,4
10
20
30
2,0
40
50
60
криохранение
(-196°С)
70
80
90
100
низкотемпературное
хранение (-18°С)
Криоконсервация
Образцы нарезают на однопочковые сегменты
спящих почек яблони
длиной до 35 мм и подсушивают в холодильнике при 5 °C до влажности 28-32%. Замораживание до -30°C
проводят в программном замораживателе, понижая
температуру со скоростью 1°C/час, затем погружают
образцы в жидкий азот. Вынутые из жидкого азота
образцы выдерживают в течение суток в
холодильнике при температуре 4° C в эксикаторах над
парами воды для гидратации.
Для проверки
жизнеспособности
обычно используется
метод окулировки почек
Метод контроля аутентичности образцов черемухи
в процессе хранения при сверхнизких температурах,
основанный на использовании молекулярного маркирования
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
ISSR М10
Контроль
Опыт
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
ISSR 812
Контроль
В ходе работы было протестировано восемь
ISSR-праймеров, два из которых показали
наиболее полиморфную картину ПЦР,
позволяющую выявить генетические различия
между анализируемыми сортами.
Метод ISSR-профилирования ДНК
позволяет установить степень
целостности ДНК почек черемухи, а
также подтвердить аутентичность
генетического материала,
сохраняемого при сверхнизких
температурах в условиях генбанка.
Опыт
ISSR-анализ ДНК образцов черемухи, выделенной из почек до (контроль) и после (опыт)
сохранения при сверхнизкой температуре. Сорта: 1- Ранняя круглая, 2- Ольгина радость, 3Августина, 4- Гранатовая гроздь, 5- Сахалинская устойчивая.
Хранение образцов
плодовых культур и картофеля
в парах жидкого азота
(на 1.10.11 г.)
Культура
Груша
Жимолость
синяя
Земляника
Картофель
Крыжовник
Малина
Слива
Смородина
черная
Черемуха
Черешня
Яблоня
Всего
Число сохраняемых
образцов, шт.
пыльца
черенки
70
21
4
26
11
4
50
81
25
10
15
17
160
464
5
63
114