Transcript lp 2…

GENA
Genomul uman este constituit din 3,5 miliarde de
perechi de nucleotide (numite şi perechi de baze
sau pb).
Genele reprezintă 3-5% din acest ansamblu.
Restul de ADN este constitut din
-secvenţele de reglare a expresiei genei,
-secvenţe repetitive şi
-secvenţe cu funcţii necunoscute.
• Varianta nepatologică a genomului este
polimorfismul
• La om, între 2 indivizi există mici variante de
secvenţe estimate între 1 şi 2% considerate
ca nepatogene şi numite gene de polimorfism
(exp. de polimorfism, culoarea ochilor: bleo,
maron, verde).
• Polimorfisumul, este dat de secvenţe scurte,
repetate, a unui număr mai mic sau mai
mare de perechi de baze care pot varia pe
fiecare din cei 2 cromozomi.
• După numărul de variaţii ale secvenţelor se
disting după talia lor:
• - secvenţe repetate simple sau STRs (short
tandem reapeats)– acestea sunt 2, 3, 4 şi 5
nucleotide de exp
• numărul lor este estimat între 50000 şi 100000
copii în genom;
• - secvenţe repetate în tandem în număr
variabil sau VNTRs (variabile number of
tandem repeats) din care :
• - secvenţe scurte repetate la mai puţin de
500 pb -SINEs (short interopersed repetitive
nucleotides elements),.
• Ex. secvenţele Alu de 4 kb - 5 kb repartizate în
genom la nivelul intronilor.
• .
• -secvenţe mai lungi de câteva milioane de
pb (în jur de 6-7 kb) LINEs (long interpersed
repetitive nucleotides elements);
• - ADN satelit α şi β.
• Sateliţii α prezenţi la nivelul centromerilor sunt
secvenţe repetate în tandem de 171 pb
constituie între 1-3% din cromozomi.
• Sateliţii β sunt secvenţe repetate în tandem de
68 pb situate în cromatina cromozomilor
acrocentrici şi a cromozomului 9.
• Structura genei
• În secvenţa genei se disting :
• -secvenţe în amonte –reglatoare care structurează
promotorul,
• - un situs de iniţiere al transcripţiei, sau „start
point” notat cu +1, locul unde este încorporat
primul nucleotid de unde începe transcripţia
• -o succesiune variabilă de exoni şi introni; exonii
traduşi, intronii netraduşi conţinând alte secvenţe
reglatoare şi în sfârşit
• -ultimul exon.
• Ansamblul mecanismelor care conduc la producerea
unui ARNm sau a unei proteine sunt desemnate prin
termenul de expresia genei.
• Promotorul situat în amonte de genă, în poziţia 5', are
între 800 şi 1000 pb. El nu este transcris şi tradus,
intervine
• în iniţierea transcripţiei,
• orientarea direcţiei în care aceasta se va derula,
• prezintă secvenţe consens pentru situl de fixare a
ARN polimerazei şi
• a unui capişon pe ARNm indispensabil pentru
transducţia sa ulterioară.
• În poziţia 3' a aceluiaşi sit de iniţiere (de la 10 la
câteva sute de baze mai departe), codonul ATG va
semnala sit de iniţiere a transducţiei adică debutul
părţii codante a genei.
• Apoi urmează o succesiune de secvenţe fie codante şi
conservate în ARN (exoni) fie necodante şi eliminate
de la transcripţie (introni).
• În general intronii nu există la virusuri şi bacterii.
Ei sunt prezenţi doar la eucariote.
Typical Gene Structure
Promoter
Coding Region
+1
transcription
• În poziţia 3' a genei pe ultimul exon, se află
unul din cei 3 codoni STOP TAA, care se
continuă cu o secvenţă de poliadenilare
AAAAA care va semnala oprirea transducţiei
la nivelul ribozomilor.
• Coada de poliadenilare este situată în aval de
codonul STOP, secvenţă care nu va fi
transdusă.
• Ea reprezintă un sit de recunoaştere pentru
secţiunea de ARNm primar şi este
indispensabilă pentru stabilitatea ARNm.
• Pot exista mai multe situri de poliadenilare
corespunzătoare mărimii diferite a ARNm. Ele
pot fi specifice ţesuturilor.
• Unele gene specifice ţesuturilor conţin 20-30 pb în
amonte de situl de iniţiere a transcripţiei, o casetă
TATA (5'TATA AA3') pe care se fixează unele
complexe proteice.
• Există gene care se exprimă în toate ţesuturile
(ubicvitare sau gene de menaj) sunt conţinute
constant în aceeaşi regiune.
• Acestea, conţin secvenţe bogate în GC (5'GGG
CGG3') pe care se fixează factori de transcripţie SP1.
• Factorii proteici numiţi şi factori de transcripţie
interactivă prezintă secvenţe reglatoare care
modulează expresia genei.
• O genă poate avea mai muţi promotori. Unii
promotori pot fi specifici ţesuturilor.
• Secvenţa unei gene apoA II
• Apolipoproteina apoA este componenta
proteică a oricărei lipoproteine, în special a
celor plasmatice.
• Ea este asociată lipoproteinelor cu densitate
mare (HDL) şi realizează stabilizarea
acestora.
• Ansamblul informaţiei genetice transcrisă
este de 3 miliarde de litere (o biblioteca de
7000 cărţi cu 300 pagini fiecare).
Secvenţa unei gene (apoA-II).
• Expresia unei gene
• Expresia unei gene este o succesiune de
sinteze chimice şi reacţii care conduc la
producerea unei proteine.
• În prima etapă are loc sinteza ARN
premesager sau ARN precursor (denumit şi
ARN heterogen sau Hn-ARN) a cărei secvenţă
este complementară catenei antisens a genei
deci identică celeilalte catene sens
• şi este orientată în acelaşi sens.
• După reacţii de maturare a transcriptului primar
ARN devine ARNm şi trece din nucleu în
citoplasmă.
• Ulterior ARNm este citit de un grup de câte 3
nucleotide de la 5 la 3 şi are loc sinteza
proteinelor de către ribozomi.
• Cuplarea aminoacizilor se realizează de la
extremitatea NH2 terminală către extremitatea
COOH terminală.
Expresia unei gene
• TRANSCRIPŢIA
• Sinteza ARN utilizând matriţa de ADN este
catalizată de ARN polimeraze ADNdependente, care utilizează nucleozid trifosfaţi
ca substrat.
• Numai un singur lanţ al dublului helix ADN
este utilizat ca matriţă.
• Întrucât dubla catenă a ADN este conservată,
sinteza ARN premesager este descrisă ca fiind
conservativă, dar întrucât se produce numai
un lanţ polinucleotidic, ea este asimetrică
• Catena de ADN utilizată ca model pentru transcripţie
este cunoscută sub numele de catenă matriţă sau
catenă antisens, în contrast cu cealaltă catenă
care este cunoscută ca şi catenă codificatoare sau
catenă sens.
• Secvenţa de baze a ARN sintetizat va fi identică faţă
de catena codificatoare, cu menţiunea că uracilul
înlocuieşte timina.
• ARN polimerazele sunt enzime multisubunitare mari
şi complexe, care au capacitatea de a identifica
locul în care este iniţiată sinteza ARN pe matriţa
ADN.
• Spre deosebire de ADN polimeraze, ARN
polimerazele nu au nevoie de amorsă. Cele două
catene de ADN se separă la locul de iniţiere a
sintezei.
• Nucleii celulelor eucariote conţin 3 tipuri distincte de
ARNpolimeraze:
• -ARN polimeraza I este localizată în nucleoli, unde
se găsesc genele ribozomale şi catalizează sinteza
precursorilor majorităţii moleculelor de ARNr 18S, 5,
8S, 28S;
• -ARN polimeraza II este localizată în nucleoplasmă
şi catalizează sinteza precursorilor ARNm şi a unor
snARN (ribonucleoproteine mici);
• -ARN polimeraza III este localizată în
nucleoplasmă şi catalizează sinteza precursorilor
moleculelor ARNr, 5S şi o varietate de mici
fragmente de ARN nucleari şi citoplasmatici (ARNt, ,
snARN, 7SL-ARN).
• Ultima linie a următoarei imagini este secvenţa
primului exon a genei apoproteinei AII. Cele
900 nucleotide care o preced conţin numeroase
secvenţe recunoscute de proteine care permit
începerea transcripţiei sau reglarea acestei
etape.
• Porţiunea de ADN care va fi transcrisă se
numeşte unitate de transcripţie. Aceasta este
delimitată de un promotor, urmat de un punct
de iniţiere sau „start point” notat cu +1, locul
unde este încorporat primul nucleotid de
unde începe transcripţia şi un terminator
unde se termină transcripţia (Fig. 19).
Secvenţa unui promotor.
• Promotorii pentru ARNpolimeraza sunt pe
latura 5' a startului (în amonte).
• Secvenţa aflată înaintea punctului start, se
numeşte din amonte, iar cea de după punctul
start, în aval.
•
Promotorului i se disting următoarele
secvenţe:
• -secvenţă numită caseta TATA(sau domeniu) ,
care este recunoscută specific prin proteinele
TFIID, cofactor al ARN polimeraza II;
• -secvenţe sau casetă CAAT şi GG box, pe care
vin să se fixeze alte proteine de transcripţie
CTF şi SP1.
• Activităţile multor promotori sunt amplificate
de către secvenţe de ADN (enhancers)
situate la distanţă până la câteva sute de
perechi de baze de promotor.
• Asemenea amplificatori sunt recunoscuţi de
proteine specifice denumite factori de
transcripţie care stimulează legarea
ARNpolimerazei de un promotor vecin.
• Faptul că amplificatorii sunt aşezaţi la distanţă
(considerând ADN liniar) faţă de promotorii pe
care îi controlează este explicat pe baza
împachetării ADN prin care ia naştere o
structură terţiară care aduce cele 2 elemente
în poziţii apropiate.
• Enhancerii. Aceste secvenţe de ADN sunt localizate
în 5' sau 3' a unei gene într-un exon sau intron.
• Funcţia lor este interdependentă de poziţie şi
orientare.
• Fiecare enhancer conţine unul sau mai multe situri
de fixare pentru un factor de transcripţie. care
acţionează sinergic. Această secvenţă stimulează
expresia genei.
• Silancerii. Această secvenţă diminuă sau inhibă
expresia genei. Sunt localizaţi adesea între promotori
şi enhanceri, sunt numiţi antienhanceri.
• Factori care acţionează în transcripţie. Sunt
proteine care acţionează asupra ADN prin activarea
sau inhibarea parţială sau totală a receptorilor
transcripţiei.
• Enzima cheie în transcrierea genelor pentru
proteine structurale este ARN polimeraza II.
• Promotorii recunoscuţi de această enzimă
sunt mult mai mari şi mai diverşi.
• Primul nucleotid (situsul start) al secvenţei ADN
este notat cu +1, urmat de +2 etc. Nucleotidul
dinaintea situsului start este notat cu-1.
• Factorii care sunt produşi ai genelor, altele
decât cele pe care ei le controlează, sunt
denumiţi factori trans-acting sau transactivatori.
• Genele individuale sunt transcrise în ARN
monocistronici individuali codificând
proteine singulare.
• Astfel trebuie să existe alte căi de coordonare
ale transcripţiei, mai ales că adesea, genele
implicate sunt pe cromozomi diferiţi.
• În acest fel, producerea unei molecule de anticorp
funcţional necesită sinteza de proteine
imunoglobulinice cu lanţ greu (H) sau uşor (L).
• În timp ce locusul lanţului greu H este pe
cromozomul 14 la om, genele lanţului uşor sunt pe
cromozomii 2 şi 22.
• O situaţie similară există şi în cazul hemoglobinei,
unde familia α-globinei este pe cromozomul 16 la
om, şi gena β-globinelor pe cromozomul 11.
• Antibioticul actinomicina D inhibă transcrierea
prin legarea de matriţă, în timp ce rifampicina
inhibă transcrierea prin legarea de
ARNpolimeraza.
• La virusurile cu ADN dublu catenar,
transcrierea va avea loc la fel ca în celulele
normale, de obicei utilizând ARN polimeraza
din nucleul celulei gazdă.
• Genele sunt situate pe cele două lanţuri ADN
de la stânga la dreapta şi de la dreapta la
stânga. Genele apolipoproteinei AI şi AIII sunt
vecine.
Catenă sens şi antisens.
• Factori de transcripţie
• De caseta TATA se leagă un complex de
proteine cunoscut ca TFIID (factor de
transcriere D pentru ARN polimeraza II).
• În acest complex numai o proteină, cunoscută
ca TPB (TATA binding protein) se leagă direct
de ADN, alte proteine ale complexului legânduse prin asociere cu TPB.
• Controlul transcrierii prin hormoni
• Mulţi hormoni îşi exercită efectele biologice
prin legarea la receptori de suprafaţa
celulară care activează mesageri secundari
cum este AMPc.
• Hormonii steroizi şi tiroxina acţionează în mod
diferit.
• Ei intră în celula ţintă şi se leagă de proteine
receptor specifice în citosol.
• Aceştia migrează în nucleu şi controlează
transcrierea prin legare la ADN şi controlează
exprimarea a 50-100 de gene.
• Reglarea expresiei genelor
• Sinteza ARNm se mai numeşte expresie
genică, deoarece din molecula de ADN
reprezentată de o genă, când este activată se
transcrie un ARNm pentru o proteină dată.
• Genele din genomul celulelor eucariote sunt
întrerupte de secvenţe care nu vor fi regăsite în
secvenţa proteinelor.
• Astfel unitatea transcriptibilă a genei la
eucariote este formată din introni şi exoni.
• Reglarea întregii căi metabolice se face în
principal de la prima reacţie pentru a nu
sintetiza intermediari inutili. Expresia unei
gene reglatoare este legată de 4 nivele:
• transcripţia;
• maturarea transcriptului;
• transducţia;
• activarea proteinelor mature.
• Punctul de control principal al transcripţiei
este ARN polimeraza I, enzima cheie a
expresiei unei gene.
• Cis şi transreglatoare
• Secvenţa nucleotidelor promotorului factorul
cis reglator este recunoscută printr-o
clasă de proteine specifice 8 factori
transreglatori a căror structură permite o
legătură cu ADN (ADN proteine de legătură).
• Factorii transreglatori influenţeză viteza
de transcripţie. Ei pot fi enhanceri cu rol
activator, sau pot fi inhibitori (secvenţe
silencer). Legătura lor cu ADN depinde de
circumstanţe fiziologice care induc sau
reprimă expresia genelor.
• Există elemente esenţiale prezente în
majoritatea genelor:
• elementul principal este caseta TATA ;
• elemente de bază, ca octamer recunoscut de
factorul OCT1 prezent în aproape toate
celulele.
• Există elemente care răspund la factori a căror
prezenţă depinde de semnale care parvin la
celule, în special hormoni ca insulina sau
mesagerii de ordinul II ca AMPc.
• Astfel, promotorul lipoprotein- lipazei conţine
TATA box, elemente ale promotorului de bază,
elemente de răspuns la hormoni şi elemente de
expresie tisulară specifice.
• În promotorul genelor există 20-30 situsuri
de fixaţie pentru factorii transreglatori din
care majoritatea au efect inductor, sau
represor asupra expresiei unei gene.
• Recunoaşterea ADN de către proteine
• Au fost identificate 3 motive proteice
importante:
•
• motivul elice-cot-elice helix-turn-helix,
• proteină de tip amprentă de Zn sau zinc finger,
• proteine fermoar de leucină -leucine zipper.
• Domeniu helix-buclă-helix, permite
legarea specifică a helixului α cu
nucleotide în marele silon, în jur de 10
perechi de baze.
Proteine de legătură ADN.
• Reglarea expresiei genelor în timpul
hipoglicemiei
• hipofiză secretă ACTH. Acesta provoacă secreţia
cortisolului de către celulele zonei fasciculate.
• Cortisolul acţionează asupra ficatului şi se leagă
de proteine specifice, receptorii pentru cortisol.
Aceste proteine leagă hormonii constituind
factorii trans-reglatori.
• Factorii transreglatori trec în nucleul hepatocitelor
se leagă de ADN la nivelul promotorului
anumitor gene care au elemente cis reglatoare
specifice: GRE (glucocorticoid responsive
element).
• Legătura factorilor transreglatori cu secvenţa
cis-reglatoare vor activa transcripţia genei în
aval de acest promotor de unde se
sintetizează mesagerul în concentraţie mare.
Mesagerii astfel produşi vor induce sinteza
enzimelor ce aparţin căii gluconeogenezei.
• Creşterea concentraţiei acestor enzime în
hepatocite va permite transformarea
aminoacizilor în glucoză, care va fi
eliberată în circulaţie şi va ajunge la creier;
are loc o creştere a nivelului glicemiei.
Reglarea hipoglicemiei
• Reglarea la efort
• Stresul activează mecanisme care pregătesc
organismul pentru efort fizic, care necesită utilizarea
glicogenului pentru contracţia musculară.
• Creierul activează medulosuprarenala pe cale
nervoasă pentru producerea adrenalinei. Dacă
concentraţia glucozei în sânge este scăzută
(hipoglicemie) pancreasul secretă glucagon. Cei
doi hormoni acţionează asupra muşchilor şi a ficatului
activând sinteza AMPc.
• Acesta din urmă este activator a protein-kinazei A,
care este capabilă să fosforileze CREB (AMPciclic
element responsabil de legarea proteinelor).
• CREB-P fosforilate vor trece în nucleul celulei şi se
leagă de ADN la nivelul promotorului unor gene, care
au un element cis reglator specific: CRE (elemente
responsabile de AMP cilcic).
• Legarea factorilor trans-reglatori (CREB
fosforilate) pe secvenţa elementelor cisreglatoare (secvenţe TGACGTCA), vor activa
transcripţia genei în aval de promotori, care
atrage sinteza mesagerilor.
• Mesagerii astfel produşi vor induce sinteza
enzimelor aparţinând căii de glicogenoliză.
• Creşterea concentraţiei acestor enzime în
muşchi vor permite transformarea
glicogenului în energie care va fi utilizată
pentru contracţia musculară.
Reglarea la efort.
• ARN polimeraza II
• Este enzima transcripţiei genelor exprimate
sub formă de proteine. Ea este inhibată
specific de toxic extras Amanite phalloide, α
amanitină.
• ARN polimeraza II este prezentă în toţi nucleii
celulelor.
• Transcripţia pe care o catalizează, necesită
ribonucleotide trifosfat ca substrat (ATP, CTP,
GTP, UTP) şi mai mulţi cofactori proteici
(factorii de transcripţie TFIIA până la TFIIJ).
• Mecanismul transcripţiei
• Iniţierea
• Primul care recunoaşte promotorul şi în special
TATAbox, este factorul de transcripţie D (s-a
notat TFIID de la transcriptional factor TF şi II
de la ARN polimeraza II). El se leagă de
secvenţa TATAbox prin TBP (TATA Binding
Protein).
• Acest factor odată legat de ADN v-a atrage şi
alţi factori de transcripţie, cât şi ARN
polimeraza.
• Dacă ARN polimerazele sunt universale,
identice pentru toate celulele şi ţesuturile,
factorii de transcripţie sunt specifici pentru
anumite ţesuturi.
• Ei joacă un rol important în diferenţierea
celulară şi menţinerea tipurilor de celule.
• Pe lângă aceşti factori de transcripţie
implicaţi direct în sinteza ARN, există şi
proteine care reglează desfăşurarea
procesului, în sensul că îl intensifică,
atenuează , nu blochează.
• Transcripţia poate începe dacă sunt prezente şi
ribonucleotidele substrat.
• Complexul de iniţiere al transcripţiei
recunoaşte o secvenţă de aproximativ 100
nucleotide a lanţului antisens de ADN.
• TFIIH provoacă deschiderea şi derularea
parţială a dublului helix la acest nivel.
• Transcripţia începe la a 22-a nucleotidă de pe TATA
box, în direcţia opusă elementelor GC-CAAT şi se
continuă crescând lanţul antisens în direcţia
extremităţii sale 5.
• Formarea acestui complex este activată sau inhibată
de factori transreglatori legaţi de secvenţa cis
reglatoare a aceluiaşi promotor.
• Legarea TFIID pe ADN
• Fixarea factorului TFIID pe TATAbox este prima
etapă a complexului de iniţiere a transcripţiei.După
această fixare se deformează dublul helix de manieră
importantă. Acest ansamblu va servi ca punct de
ancoraj pentru alţi factori de iniţiere a transcripţiei ,
după cum urmează:
• -complexul ADN-TFIID acţionează ca un situs de
legare pentru un alt factor: TFIIB care leagându-se va
stabiliza complexul. Acest factor are acţiune ATPazică, eliberând energia necesară desfacerii catenelor
de ADN, pentru formarea aşa zis-ului complex deschis
(open);
• -la acest complex se asociază alţi factori : TFIIE şi
TFIIH;
• -apoi la acest complex se leagă ARN polimeraza II şi
în urma unui proces ATP-dependent începe iniţierea
transcripţiei. Iniţierea începe cînd s-a format
complexul de iniţiere, la nivelul promotorului genei
ţintă;
• -la acest complex se asociază un alt factor : TFIIF,
care este factorul de elongaţie.
• Acest factor împiedică terminarea prematură a
sintezei ARN.
• ARN polimeraza I şi II formaeză complexe cu
factori de transcripţie care se leagă upstream
(deci înaintea punctului de iniţiere) pe când
majoritatea factorilor de transcripţie pentru ARN
polimeraza II se leagă downstrem (chiar la
mijlocul unităţii de transcripţie).
Iniţierea transcripţiei
• Reglarea ARN polimerazei
• Activatorii sau inhibitorii transcripţiei (factori
trans-reglatori) sunt proteine produse de ARN
polimeraza II şi ca urmare induc sau reprimă
expresia genelor transcrise.
• Situsul de fixare a acestor factori transreglatori
pe ADN sunt secvenţe specifice numite
elemente cis reglatoare.
• Cuplul elemente cis reglatoare cu factorii
transreglatori legaţi, intră în contact cu
complexul de iniţiere a ARN polimeraza prin
intermediul unui ansamblu de proteine
numite mediatori.
Reglarea ARN polimerazei