Transcript LezioneUVVIS

UV-VIS
Dott. Alfonso Zoleo
Laboratorio di Metodologie Spettroscopiche per le Biotecnologie AA 2013-2014
Concetti fondamentali
Trasmittanza: T= I /I0
 quanta luce è trasmessa
[c], 
I0(l)
I(l)
l
Legge di Lambert-Beer
1
log    Al   l cl
 T l
Assorbanza: A=log(I0/ I)
= log(1/T)
 quanta luce è assorbita
Cammino ottico (in cm)
Concentrazione (in mol l-1)
Al = assorbanza
l = assorbività molare o coefficiente di estinzione molare (in M-1 cm-1)
Concetti fondamentali
Additività delle assorbanze
A  A1  A2  A3  ...  1 (l )bC1   2 (l )bC2   3 (l )bC3  ....
L’assorbanza totale è la somma delle assorbanze delle singole specie
Equilibri protici in soluzione
HnA
Hn-1A
Hn-2A
+
H+
[ H  ][H n1 A]
K1 
[ H n A]
+
H+
[ H  ][H n2 A]
K2 
[ H n1 A]
Hn-3A- + H+
[ H  ][H n3 A]
K3 
[ H n2 A]
Hn-1
A-
Hn-2
A-
Molte sostanze organiche e biologiche contengono eteroatomi (N,O,..) e
possono protonarsi e deprotonarsi: lo spettro UV-VIS è spesso la somma
degli spettri risultanti dalle diverse specie!
Concetti fondamentali
Fluoresceina in soluzione acquosa a vari pH
basico
acido
Come conseguenza degli equilibri protici, lo spettro UV-VIS di
un colorante in acqua dipende spesso dal pH
Concetti fondamentali
La fluoresceina è presente in quattro forme protiche
K2
-
K1
K3
+
H
-
-
Concetti fondamentali
+
-
H
-
Il dianione della fluoresceina è la specie con l’assorbività più alta, con un
massimo a 490 nm
Concetti fondamentali
Conviene avere in soluzione la sola specie dianionica
H3
F+
H2F
HF-
H+
[ H  ][H 2 F ]
 2.08
K1 

10
[H3F  ]
HF- + H+
[ H  ][HF  ]
K2 
 104.31
[H 2 F ]
H2F +
F2-
+
H+
[ H  ][F 2 ]
K3 
 106.43

[ HF ]
 F 2 
 F 2 
  6.43  log

pH  pK3  log
 
 
HF 
 HF 
2 
[F ]
Imponiamo la condizione:
 100

HF

( il 99% in forma dianionica)
pH>8.43

In laboratorio
Scopo dell’esperienza: determinazione dell’assorbività molare in acqua
a 490 nm della fluoresceina dianione
Ogni gruppo deve preparare 5 soluzioni a differenti concentrazioni fra 20 mM
e 2 mM
Si parte da una soluzione madre 1 mM di fluoresceina
Ogni gruppo prepara una
soluzione 20 mM a partire
dalla soluzione madre. La
soluzione va portata a
pH=10 con NaOH 0,1 M
1 ml
50 ml
50 ml
1 ml di sol. 1 mM + 5 ml di
NaOH 0,1 M diluiti a 50 ml
In laboratorio
10 ml
10 ml
10 ml
Ogni gruppo dispone di tre matracci da 10 ml e due pipette tarate da 3 e 5 ml.
Con questa attrezzatura prepara tre soluzioni a partire dalla soluzione 20 mM :
1) 8 ml di soluzione 20 mM + 0.5 ml di NaOH 0.1 M in 10 ml
2) 5 ml di soluzione 20 mM + 0.5 ml di NaOH 0.1 M in 10 ml
3) 3 ml di soluzione 20 mM + 0.5 ml di NaOH 0.1 M in 10 ml
Si effettuano 4 misure di assorbanza: delle soluzioni 1), 2) e 3) e della
soluzione madre da 20 mM.
Si svuota il matraccio della soluzione 2) e si usa per preparare la soluzione
4: 5 ml di soluzione 3) + 0.5 ml di NaOH 0.1 M diluiti a 10 ml.
Sulla soluzione più diluita si effettua una misura di fluorescenza
In laboratorio
Elaborazione
A
(A0,C0)
(A1,C1)
Le assorbanze a 490 nm sono
diagrammate contro le
relative concentrazioni
(A2,C2)
A= b C
(A3,C3)
(A4,C4)
C
Dal fitting dei punti si ricava la pendenza e l’errore relativo:
Dalla pendenza, noto il cammino ottico (1 cm) si ricava l’assorbività
molare a 490 nm. Indicare l’errore sull’assorbività.
Relazione
Ogni gruppo deve presentare una relazione sulle misure UV-VIS
La relazione deve essere essenziale:
1)Max. una paginetta di introduzione con le basi e l’obiettivo del lavoro
2)Max 2 pagine di parte sperimentale