Transcript 第12章突变和重组机理
第十二章 突变和重组机理 重点：突变的分子机理、重组的分子机 理、基因转变、遗传重组的 Holiday模型，DNA损伤的修复。 难点：基因转变、遗传重组的Holiday 模型、转座子及转座机理。 1 第一节 突变的分子基础 一、自发突变 二、诱发突变 2 一、自发突变 DNA复制错误 3 4 自发的化学变化 脱嘌呤 5 脱氨基 NH 2 O H H H N N Deamination H N Cytosine O H N Uracil Fig. 21- Deamination of cytosine to uracil. O 脱氨基 NH 2 O H H H N N Deamination H N Cytosine O H N Uracil Fig. 21- Deamination of cytosine to uracil. O NH 2 O H3 C H3 C H N N Deamination H N O 5-methyleytosine (5mC) H N O Thymine (T) Fig.21- Deamination of 5-methylcytosine to thymine. 氧化损伤 过氧化物原子团(O2-)、(H2O2)，(OH)等需氧代谢的副产物都是有活性的氧 化剂，它们可导致DNA的氧化损伤。T氧 化后产生T－乙二醇，G氧化后产生8-氧7,8二氢脱氧鸟嘌呤、8-氧鸟嘌呤(8-OG)或“GO”，GO可和A错配，导致G→T。 第二节 重组的分子基础 一、基因重组的可能机理 二、基因转变 三、遗传重组的分子基础 10 一、基因重组的可能机理 染色体断裂愈合模型 1、两同源染色体之间的联会和环绕。 2、染色体复制，姐妹染色单体环绕。此时 ，同源染色体由之前的相互吸引变成相 互排斥。 3、螺旋松开，两个非姐妹染色单体断裂。 4、重新愈合，发生交换。此时可观察到交 叉现象。 11 即染色体复制完成后发生非姐妹染 色单体的断裂和重新愈合，从而造成重 组。所形成的4个染色单体中，一半是亲 组合类型，一半是重组合类型。 该模型的不足之处在于不能解释一 个减数分裂的4个产物不呈2：2分离的现 象。 12 模写选择模型 13 该模型认为重组是由于染色体复制 过程中非姐妹染色单体交换模板造成的 ，从而形成一半的亲组合和一半的重组 合，且每条DNA链都是正常配对的。 该模型的不足之处： 不能解释三线或四线双交换现象； 该模型要求DNA的全保留复制，而事 实上DNA是半保留复制的。 14 二、基因转变 基因转变：一个基因转变为它的等位基因 的现象称为基因转变。 染色单体转变：减数分裂的四个产物中， 有一个产物发生了基因转变的现象。 半染色单体转变：减数分裂的四个产物中 ，有一个产物的一半或两个产物的各 一半出现基因转变的现象。 15 基因转变现象 16 三、遗传重组的分子基础 遗传重组的Holiday模型 同源染色体复制，形成4条染色单体 两条非姐妹染色单体的DNA单链上产 生缺口 缺口交联并移动 产生异 源双链区 形成中空的十字构型 产生缺口，重新连接。 17 18 最后形成的染色体类型中，每条DNA 双链都存在异源双链区，即存在不配对 的区域。异源DNA是不稳定的，如果这些 异源DNA区都得到正确修复，则一次单交 换所产生的亲组合和重组合呈现正常的 分离比(1：1)；如果未全部正确修复或 未修复，都会出现基因转变现象，从而 出现异常的分离比(6：2，3：1：1：3， 5：3)。 19 异源DNA的修复 正确修复和错误修复 修复所需酶 核酸外切酶：识别错配DNA片段，随机 切除其中的一条DNA单链。 DNA多聚酶：修复缺口，合成新链与留 下的单链配对。 连接酶：将合成的新链与所在的旧链连 接，成连续的链。 20 修复结果 正确修复：A所在的链被切走，最后被修 复为野生型(如果本来的链就应是野 生型)。 错误修复：G所在的链被切走，被修复为 突变型(如果本来的链就应是野生型) 。 21 用遗传重组的异源DNA模型说明基因 转变的起源： 1）两条单链都得以正确校正，则呈 现正常分离； 2）一条单链正确校正，一条单链错 误校正，则呈现6：2的异常分离； 3）两条单链都未校正，留给下次有 丝分裂，则呈现3：1：1：3的异常分离； 4）一条单链正确校正，一条未校正 ，则呈现5：3的异常分离。 22 第三节 转座遗传因子 一、转座元件的发现和鉴定 二、原核生物的转座因子 三、真核生物的转座因子 23 一、转座元件的发现和鉴定 Emerson（1914）玉米种子色素的遗传： 回复突变 花斑 Rhoades（1938）玉米种子糊粉层色素遗 传：二个基因相互作用，与回复突变 有关。 24 McClintock（1944）： 玉米第 9 条染色体三个连锁基因： Ds Wx Sh C 想通过 “桥－断片－桥” 去掉染色体末端的基因 C。 但是发现： — 常常得到的是从着丝粒与Wx之间断裂的，丢失三 个 基因的染色体。她定义为“ Ds ”（dissociation） — 偶尔发现 Ds 可以跳到 C 内的某一位置：种子为无 色 — 在种子发育过程中，Ds 可以从 C 跳出：种子大部分 无色，少量斑点。 25 26 二、原核生物的转座因子 原核转座因子的类型 1）插入序列 插入序列(Insertion sequence，IS) 是一种转座子，可以整合到宿主非同源 位点上。若IS插入到某基因内，通常该 基因就会失活。正常的细菌基因组和质 粒都含有IS。 27 插入序列的结构特征： 含短的末端反向重复序列； 含编码转座酶的基因。转座酶的编 码起始点位于一端的反向重复序列内。 终止点则正好位于另一端的反向重复序 列之前或中间； 靶位点存在5-9 bp的短正向重复序 列。 28 IS的转座是由转座酶催化的，首先 转座酶交错切开宿主靶位点，然后IS插 入，与宿主的单链末端相连接，余下的 缺口由DNA聚合酶和连接酶加以填补，结 果使插入的IS两端形成了DR或靶重复。 29 30 2）复合转座子： 一类带有某些抗药性基因（或其它宿 主基因）的转座子，其两翼往往是两个 相同或高度同源的IS序列。表明IS序列 插入到某个功能基因两端时就有可能产 生复合转座子。一旦形成复合转座子， IS序列就不能再单独移动，因为它们的 功能已被修饰，只能作为复合体移动。 31 复合转座子的结构特征： 中间区域含编码转座酶以外的标记 基因； 两端具有插入序列； 两末端是反向重复序列； 靶位点存在短正向重复序列。 32 33 转座机制 所有转座子的共同机制： 在靶DNA上造成交错切口，转座子与 突出的末端相连，填补缺口。 34 转座类型 据转座子的移动机制，可分为： 复制型转座(replicative transposition) 非复制型转座(nonreplicative transposition) 保守型转座(conservative transposition) 35 复制转座：转座因子在转座期间先复制 一份拷贝，而后拷贝转座到新的位 置，在原先的位置上仍然保留原来 的转座因子。复制转座有转座酶和 解离酶的参与。转座酶作用于原来 的转座因子的末端，解离酶则作用 于复制的拷贝。 36 复制型转座 37 非复制转座：转座因子直接从原来位置 上转座插入新的位置，并留在插入 位置上，这种转座只需转座酶的作 用。非复制转座的结果是在原来的 位置上丢失了转座因子，而在插入 位置上增加了转座因子。这可造成 表型的变化。 38 非复制型转座 39 保守型转座：也是非复制转座的一种类 型。其特点是转座因子的切离和插 人类似于λ噬菌体的整合作用，所 用的转座酶也是属于入整合酶家族 。出现这种转座的转座因子都比较 大，而且转座的往往不只是转座因 子自身，而是连同宿主的一部分DNA 一起转座。 40 保守型转座 41 转座引起的遗传学效应： 引起插入突变 产生新的基因 引起生物进化 引起染色体畸变 42 某些转座子只具有一种转座机制 ，而另一些可能具备两种途径。两个 正向重复(DR)之间的重组使夹在两个 DR中间的DNA序列被切离而产生缺失。 两个反向重复(IR)之间的重组使夹在 两个IR中间的DNA序列发生倒位。 43 44 45 三、真核生物的转座因子 玉米中的控制因子 玉米基因组中含有几个控制元件家族。每 个家族的成员可分为两类： 1）自主控制元件 Autonomous controlling element 特点：具外切和转座的能力 2) 非自主控制元件 Nonautonomous controlling element 特点：稳定；可被自主控制元件激活 46 47 在Ac-Ds系统中，大部分自主元件Ac 由含有5个外显子的单个基因组成，其产 物是转座酶，它的末端有11bp的IR和8bp 的DR，DR是由靶位点重复而成。Ds元件 与Ac的结构相同，但内部有缺失。各种 Ds的长度和序列都不相同，但和Ac有关 ，其末端同样有11bp的IR。 48 49 第四节 DNA损伤的修复 一、紫外线照射对DNA的损伤 二、光复活 三、暗复活 四、复制后修复 50 一、紫外线照射对DNA的损伤 紫外线是一种有效的杀菌剂。用紫 外线照射细菌，并把细菌培养在黑暗中 ，那么细菌被杀死的数量与照射剂量成 正比。如果细菌接触可见光，大部分细 菌就能活下来，这是光能修复辐射引起 的损伤的证据。 51 紫外线主要作用在DNA上,因为用波长 260nm的紫外线照射细菌时,杀菌率和诱变 率都最强，而这个波长正是DNA的吸收峰 。紫外线照射后对DNA发生了什么影响呢 ？紫外线照射后，DNA最明显的变化是同 一链上的两个邻接嘧啶核苷酸的共价联结 ，形成嘧啶二聚体。最常见的是胸腺嘧啶 二聚体(TT)，此外还有胞嘧啶二聚体(CC) 以及胸腺嘧啶和胞嘧啶二聚体(CT)。 52 这些嘧啶二聚体使双螺旋的两链间的 键减弱，使DNA结构局部变形，严重影响 照射后DNA的复制和转录。含有嘧啶二聚 体的DNA的链，使它不能作为DNA复制的样 板，新合成的链在二聚体的对面和两旁留 下了缺口。紫外线引起的DNA的损伤的修 复，大致上通过3个途径：(1)在损伤部位 就地修复——光复活；(2)取代损伤部位 ——暗修复或切除修复；(3)越过损伤部 位而进行修复——重组修复。 53 二、光复活 光复活修复作用是一种高度专一的 DNA直接修复过程，它只作用于紫外线引 起的DNA嘧啶二聚体(主要是TT,也有少量 CT和CC)。在暗处，光复合酶能认出紫外 线照射所形成的嘧啶二聚体，并与之结合 ，形成酶和DNA的复合物，但不能解开二 聚体。照以可见光时，可见光(有效波长 为400nm左右)激活光复活酶，使之能分解 紫外线照射而形成的嘧啶二聚体。 54 55 三、暗复活 暗复活过程具有更重要的意义，它并 不表示修复过程在黑暗中进行，而只是说 ，光不起任何作用。这种修复过程不是简 单地由另一种酶来拆开二聚体，而是利用 双链DNA中一段完整的互补链，去恢复损伤 链所丧失的信息；就是把含有二聚体的DNA 片段切除，然后通过新的核苷酸链的再合 成进行修补，所以又叫做切除修复。切除 修复有两种情况，一是先补后切，一是先 切后补。一般认为先补后切比较合理。 56 57 58 大肠杆菌的切除修复系统不仅能修 复嘧啶二聚体，也能修复DNA双螺旋的其 他损伤。该系统的修复机制为先切后补 。这个双螺旋的结构变形可被UvrABC内 切核酸酶识别，这种多亚基的酶由3个基 因(UvrA、UvrB和UvrC)编码。 59 在E.coli中的切除修复系统 切除：外切酶除去切口间的DNA 损伤：突变的碱基错配或改变DNA结构 剪切：内切酶在损伤碱基位点两侧剪切 合成：DNA pol 合成取代DNA 连接酶封闭缺口 首先是UvrAB组合在一起识别嘧啶二 聚体和其它大的损伤。然后UvrA解离（ 此需ATP）而UvrC和UvrB结合，UvrBC复 合体在损伤位点的两侧面剪切，在损伤 位点5’端相距7个nt处，3’端相距3～ 4nt处剪切，此过程也需ATP，UvrD是一 种解旋酶，它可以帮助DNA解旋，让两个 缺口间的单链片段（包含损伤位点）释 放出来。 61 Deformation of DNA UvaA UvaB UvrA recognizes damage & binds with UvrB UvaC UvaB UvrA released; UvrC binds UvaC UvaB UvrC nicks DNA on both sides of damage Uva D UvrD unwinds region Fig. 21- The Uvr sistem operates in stages in which UvrAB recognizes damage, UvrBC nicks the DNA, and UvrD unwinds the marked region. Uvr系统在 修复各阶段中的 作用： UvrAB识别损伤 ； UvrBC在DNA上 切一缺口； UvrD使被标记 区解旋。 特殊切除修复途径 1）AP核酸内切酶修复途径 各种细胞中都有一种核酶内切酶，它 附着在自发丢失了单个嘌呤或嘧啶的位点 上，这个无嘌呤(apurinic)和无嘧啶 (apyrimidinic)位点就叫做AP位点。AP内 切酶是细胞所必需的，因为自发地脱嘌呤 作用经常发生，这种酶可以通过剪切AP位 点上的磷酸二酯键使链断裂。这是起始 切除-修复；进一步由3种酶：外切酶，DNA Po1I和连接酶进一步进行修复。 2) 糖基酶修复途径 由于AP内切酶修复途经的功效，它 可能是其它修复途经最后的一步。这样 如果损伤的碱基对能被切除的话，那么 就留下一个AP位点，AP内切酶就能使野 生型完全得到恢复。这就是糖基酶修复 途径。 65 DNA糖基酶(glycosylase)并不能剪 切磷酸二酯键，但可以剪切N-糖苷键。 释放出改变了的碱基，产生一个AP位点 。再经过AP内切核酸酶切割磷酸二酯键 ，再由DNA聚合酶Ⅰ的外切核酸酶活性和 5’ 3’的合成活性进行修复，最后由 连接酶封闭缺口，完成修复。 66 Nucleotide containing damaged base A 5’ 3’ A AT CGTAGATAGCTAA TACCAT C TAT C G AT T 3’ 5’ 5’ A 3’ AT CGTAGATAGCTAA TACCAT C TAT C G AT T 3’ 5’ 5’ 3’ A AT CGTAGATAGCTAA TACCAT C TAT C G AT T 3’ 5’ 5’ 3’ A AT CGTAGATAGCTAA TACCAT C TAT C G AT T 3’ 5’ Glycosylase enzyme recognizes damaged base and cleaves bond between base and sugas, releasing the base. AP endonuclease cleaves phosphodiester bond next to missing base. DNA polymerase I repairs region by rmoving nucleotides in the 5‘ to-3’ direction and inserting new DNA in the resulting gap 5’ -to-3’ direction DNA ligase seals the remainig nick.. 5’ 3’ A AT CGTAGATAGCTAA TACCAT C TAT C G AT T 3’ 5’ Fig. 21- Repair of AP site. DNA糖基酶有很多种，其中之一是尿 苷-DNA糖基酶，它可从DNA上切除尿苷， C因自发脱氨基而产生U，若不修复可能 导致C→T的转换。实际上在DNA中只有 A∶T配对而没有A∶U配对，这是由于偶 尔掺入的U可被识别和切除之故。若U是 DNA中的正常成份，那么这种修复就无需 要了。 68 还有一种糖基酶，它可识别和切除 由A脱氨而产生的次黄嘌呤（H）。另一 些糖基酶可切除被烷化的碱基（例如3m-A, 3-m-G和7-m-G），开环嘌呤，氧化 损伤的碱基以及在某些生物中的UV光化 二聚体。一些新的糖基酶仍不断被发现 。 69 3)GO系统 mutM和mutY基因产生的两中糖基酶一 道作用，阻止突变产生的8-O-G或“GO” 。这些糖基酶形成了GO系统。当GO丢失时 DNA中会因自发氧化作用造成损伤，切除 GO损伤的是由mutM基因编码的一种糖基酶 。如果在复制时产生了氧化损伤形成GO， 经复制C仍和GO配对，而GO和A配对，若得 不到修复就导致了C∶G→A∶T，但mutY编 码的糖基酶MutY可切除错配的A，经复制 恢复为GO∶C。 70 如果在复制的底物中掺入了8-0-G, 一种情况是它就可能和模链上的A配对， 但细胞中有一种糖基酶MutT，它起到 dUTPase酶的作用，使8-O-GTP→8-O-GMP ；这样它就不能作为DNA合成的底物了。 即使如此还是有部分GO逃过了MutT酶的 “监视”，仍然掺入到DNA中和A结合， 糖基酶MutY可以将错配的A切除，通过复 制反而产生了C∶G。使原来的 A∶T→C∶G。另一种情况是GO掺入到模 板中，和C配对，当糖基酶切除GO后可排 除产生A∶T的危险，仍保持C∶G对。 71 (a) 复制 C GO C C G GO 氧化损伤 A Mut Y A GO GO C GO GO C C G Mut M (b) 加入 4 种 碱＋8-0-G 复制 8-0-GTP 8-0-GMP 5’ 3’ Mut T A GO A T A Mut M GO C T A GO C GO A G C 图 21- 8-氧鸟嘌呤(8-O-G) GO 修复系统 G C 四、复制后修复 错配修复 有些修复途径能够识别DNA复制中出 现的错配，这种系统叫做错配修复系统， 假设要你设计一个可以修复复制错误的酶 ，那么这个酶应当是什么样的呢？看来至 少它要具备以下三个功能：(1) 识别错配 的碱基对；(2) 对错配的一对碱基要能准 确区别哪一个是错的，哪一个是对的； (3) 切除错误的碱基，并进行修复合成。 73 以上第二点是这个系统最为重要的 特点，除非它能区分错误和正确的碱基 ，否则错配修复系统就无法决定切除哪 一个碱基。例如5-m-C脱氨变成T，有一 个特殊的系统要将此修复成正常的顺序 。脱氨的结果使得C∶G→G∶T错配，这 个系统必须将G∶T修复成C∶G，而不是 A∶T。 74 Template strand with correct base 5’ N6-methyl adenine * Template DNA strand 3’ GATC CTAG 3’ Newly-made DNA with incorrect 5’ Unmethylated adenine * GATC CTAG * GATC CTAG Newly made DNA strand 3’ Mismatch enzyme binds to 5’ unmethylated GATC on new strand and to mispaired 3’ base on the same strand. 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ * GATC CTAG Fig. 21- Mechanism of mismatch correction repair. 3’ 5’ Mismatch correction enzyme excises section of new DNA strand ,including mispaired base. DNA polymerase repairs the gap , producing correct Base. MutS MutL MutS识别错配 位点,并易位到 GATC位点。 MutH在GATC 位点剪切非甲 基化链，内切 酶从GATC到错 配位点降解 DNA MutS MutH 重组修复（recombination-repain） 这个系统是在DNA复制时模板链上含 有损伤的碱基导致子链产生裂缺，这是 在复制时产生的，所此修复系统也属于 复制后修复。若DNA上的一条链含有结构 变形，如嘧啶二聚体，当DNA复制时二聚 体就使损伤位点失去做模板的作用，复 制就跳越过这一位点。DNA Po1可能继续 前进或者在嘧啶二聚体附近再重新开始 合成。 77 这样在新合成的链上留下了一个裂 缺，使两个子链的性质不同。一条子链 的亲代链上含有损伤，新合成的相应位 点上有一个裂缺。另一条子链的亲代链 是完好的，没有损伤，新合成的互补链 也是正常的。恢复系统就利用了这条正 常的子链。 78 损伤子链的缺口由正常子链上的同源 片段通过重组来填补，随着单链交换，受 体的双链有一条是亲代有损伤的链，另一 条经重组后变成为野生型的链；而供体双 链有一条正常的新链和一条带有裂缺的亲 代链，这个裂缺可通过一般的修复系统（ DNA Po1Ⅰ）来修复，最终产生一条正常的 双链。这样损伤就限制在原来的链上，不 至影响到新合成的DNA。 79 80 SOS修复系统 SOS修复故名思意是一种急救性的修 复，忙中就难免有错，故也叫差错倾向 修复（Error prone repair）这种修复 是为了保命也就管不了修补的片段是否 正确，，而SOS修复正是与“宁可玉碎， 不可瓦全”反其道而用之。 81 Jeam Weigle等曾用紫外线照射λ噬 菌体然后再去感染细菌，而细菌又分为 两组，一组是事先也用UV照射过，另一 组是没有照射过，结果前一组中λ噬菌 体的存活率反而高于后一组，这是什么 缘故呢？以上的现象称为UV-复活，也叫 做W-复活，现在称为SOS反应（SOS response）。原来这是一系列相关蛋白 与RecA蛋白及LexA阻遏物相互作用的结 果。 82 SOS反应的起始是通过损伤的处理， RecA的活化而引起。其它修复途径的酶是 已存在于细胞中的，而SOS修复的酶系统 是经损伤诱导才产生的。诱导的信号可能 由DNA释放出的小分子组成的，或者是DNA 本身某些结构变化。在体外RecA的激活需 要单链DNA和ATP的存在。这样激活信号可 能存在于损伤位点的单链区。无论信号是 怎样产生的，它和RecA的相互作用是很快 的，SOS反应在产生损伤的几分钟内就发 生了。 83 RecA的激活导致LexA的基因产物的 剪切。LexA是一种小分子蛋白（22KDa） ，在被处理的细胞中是相对稳定的，它 的功能是很多操纵子的阻遏物。此剪切 反应是很特殊的；LexA有一种潜在的蛋 白酶活性，它可被RecA激活，当RecA被 激活后又可导致LexA自我催化它本身的 裂解，这样LexA的阻遏功能失去了活性 ，并且同时诱导了它所结合的操纵子。 84