Transcript deuxième partie: HPLC

III -La Chromatographie
liquide haute performance
Les différents type de Chromatographie Liquide
L’appareillage
La chromatographie d’adsorption
La chromatographie de polarité de phase normale
La chromatographie de polarité de phase inverse
Les modes de travail
Les détecteurs
Les domaines d’application
La chromatographie planaire
1- Les différents types de CL
Soluté
Phase
stationnaire
Phase
mobile
Domaines d’application
– Masse molaire élevée >10 000 g/mol
• Espèces non polaires :
perméation sur gel
• Espèces polaires ou ioniques :
filtration sur gel
– Espèces ioniques à faible masse
molaire
• Echange d’ions
– Petites molécules non ioniques
• Chromatographie de partage
2
2- L’appareillage
2-1- Le chromatographe
Solvants
d’élution
Pompes
Dégazeur
Injecteur
Colonne
Détecteur
Collecte
de
données
Chaque paramètre
chromatographique doit être
optimisé pour assurer l’analyse
qualitative et quantitative
–
–
–
–
–
La phase mobile
La phase stationnaire
Dimension de la colonne
Le volume d’injection
Le traitement de
l’échantillon
– Le débit de la phase
mobile
– La température de la
colonne
– Le détecteur
3
2-2- Les solvants
Compatibilité avec le système de détection
–
–
Pas d’absorption aux longueurs d’onde de travail (détection par absorption)
Indice de réfraction de la phase mobile différent de celui des solutés (détecteur réfractomètres)
Miscibilité et solubilité des solutés
Viscosité
–
–
Une augmentation de la viscosité diminue les coefficients de diffusion et de transfert de masse :
diminution du nombre de plateaux théoriques
La pression en tête de colonne augmente proportionnellement à la viscosité de la phase mobile
Température d’ébullition
–
Problème de dégazage
Pureté des solvants
–
–
Alcanes transparents jusqu’à 190 nm mais les traces d’oléfines absorbent vers 250 nm
Oxygène dissout augmente la longueur d’onde limite de détection
Toxicité et dangerosité
–
Attention aux solvants chlorés et aromatiques
• Force éluante
• Polarité
• Coefficient de partage eau/octanol
4
2-3- Les problèmes de dégazage et les dégazeurs
Détérioration de la colonne
Bruit lié à la pompe
Problème de détecteur
Efficacité du dégazage
Les dégazeurs
• Dégazage à l’hélium
• Dégazage sous vide
• Dégazage par ultra sons
5
2-4- Les pompes
–
–
–
–
Assurent l’écoulement de la phase mobile dans la colonne
Doivent être très puissantes : P = 420 bars
• Viscosité des solvants
• Granulométrie de la phase stationnaire
Généralement pompes à pistons alternatifs
• Petit volume interne
• Pression de sortie élevée (700 bars)
• Débit constant quelque soit la pression dans la colonne
Attention aux propriétés physiques de remplissage des colonnes: doivent résister à de fortes pressions
6
Pompe isocratique
Pompe binaire: 2 pompes
Pompe quaternaire
- 1 seul solvant délivré
- Travail en mode isocratique


Avantages
- Faible chambre de mélange
- Travail en mode gradient
- Mélange des solvants à haute pression
- Gradient le plus reproductible
(débit et composition extrême)
- Gradient le plus rapidement délivré
Inconvénients
- Plus complexe et plus cher
- Problèmes de cavitation avec certains
solvants

Avantages
- Maximum 4 solvants délivrés
- Travail en mode gradient
- Une seule tête de pompe
- Prix plus faible
Inconvénients
- Moins performants aux conditions
extrêmes
- Gradient moins précis et
reproductible
- Nécessite un dégazage en ligne

7
2-5- L’injecteur
Vanne à haute pression à 6 voies
– Injection brève pour ne pas perturber le régime
d’écoulement dans la colonne
– Grande reproductibilité
8
2-6- La colonne
•
•
•
•
Généralement courtes et en acier inoxydable
– Longueur de 10 à 25 cm
– Diamètre de 4 à 5 mm
Elles sont remplies de phase stationnaire
– Billes de 5 à 10 µm de diamètre
– Phase liquide déposée sur des billes (silice)
Nombre de plateaux théoriques varie de 1000 à 50000
Souvent précédée d’une colonne de garde
Colonne
Diamètre dc
Volume VC = VM + VS
Phase mobile (Eluant)
Viscosité 
Volume VM = Vi + Vp
Vi Intergranulaire
Vp Porosité (stagnation)
Vitesse d’écoulement u
u
Phase stationnaire
Particules de taille moyenne dp
Volume VS
9
Lois de Darcy
u
L
tm
0

K ΔP
Lη
P = Pe-Ps : perte de charge L : longueur de colonne
Perméabilité spécifique de la colonne K0
Porosité de la colonne
Intergranulaire
Intragranulaire
Totale
i 
p 
T 
Vi
K
0
 d
2
p
d
2
p
VT
Vp
VT
Vm
VT
K
0

 i3
180 (1   T )

2
Facteur de résistance
En général : T = i
10
2-7- Les détecteurs - Termes généraux et concepts
Sélectivité
–
Un détecteur non sélectif réagit avec la solution qui passe dans la cellule. quand un composé est élué…
–
Un détecteur sélectif ne réagit pas avec la solution mais mesure une réponse due à une propriété de la
molécule de soluté (i.e. UV absorbance)
Sensibilité
–
Plus petit signal détectable: signal/bruit=3
Domaine de linéarité
–
Pente et interception
Limite de détection et de quantification
–
Limite de détection = la plus petite quantité d’analyte qui peut être détectée (3 fois le bruit de fond)
–
Limite de quantification = la plus petite concentration d’analyte, dans une certaine matrice, qui peut être
mesurée (10 fois le bruit de fond)
11
Détecteur
linéarité
sélectivité
sensibilité
UV
5
moyenne
0,5 – 1,0 ng
Indice de réfraction
4
faible
1 – 5 µg
fluorescence
2
grande
10 – 100 pg
faible
10 – 50 ng
2
grande
50 – 500 pg
3-4
grande
10 – 100 fg
Conductivité
électrochimique
Spectrométrie de masse
12
2-7-1- Détecteur UV-Visible
Détecteur le plus utilisé en HPLC
– Rempli un nombre important de critères du détecteur idéal
• Sensibilité
• Linéarité
• Réponse pas affectée par des fluctuations de température
• Sélectif et utilisable en gradient d’élution
A   log
Mesure de l’absorbance : loi de Beer-Lambert
 I0 

 I
 

   l  C


Gamme de longueurs d’onde : 210 – 850 nm
– 180 – 380 nm : lampe deutérium
– 380 – 800 nm : lampe tungstène
2-7-2- Le détecteur à barrettes de diodes
•
•
•
•
•
•
Détection à une seule  ou à plusieurs 
Acquisition dynamique du spectre
Obtenir le spectre de chaque composé
Détection simultanée à 2  (pureté)
Soustraction de  (compensation de dérive
de ligne de base)
Déconvolution des spectres
Phénomène de
co-élution de pics
Analyse de pureté de pics avec un
D.A.D. ( diode array détector ) :
déconvolution
2-7-3- Détecteur fluorimétrique
Luminescence
– Absorption d’un photon : augmentation de l’énergie – passage de S0 à un état singulet S1 ou S2
– Perte d’énergie selon différents processus
• Luminescence (état excité à état fondamental)
– Photoluminescence lorsque la lumière est source d’excitation
• Fluorescence
– Energie absorbée est distribuée en niveau de rotation et vibration
– Retour à l’état fondamental sans émission de lumière : relaxation
– Puis émission d’énergie
• phosphorescence
Emission se fait à  supérieur
Lentille et miroir focalisent
et dirigent la lumière vers le
réseau d’émission
La lumière est collectée à
angle droit et focalisée par la
lentille
Monochromateur disperse la
lumière émise et la dirige
vers le photomultiplicateur
Photocathode qui convertit
les photons en électrons
Lampe
Spectre entre 200
et 900 nm
Photodiode mesure le
spectre d’émission
Monochromateur à réseau
concave diffracte la lumière
vers la cellule
Cellule en quartz
3- La chromatographie d’adsorption
•
•
Phase stationnaire solide
– Silice ou alumine
Phase mobile
– Caractérisée par la force éluante ε0 : énergie d’adsorption du solvant par unité de surface
– ε0 pour l’alumine (ε0silice = 80% ε0alumine)
ln k  A   B
0
Augmentation de ε0 de 0,05 unité diminue k d’un facteur compris entre 3 et 4
Solvant
ε0
Solvant
ε0
Solvant
ε0
Fluoroalcanes
-0,25
Toluène
0,29
Nitrométhane
0,64
Cyclohexane
-0,2
Ether éthylique
0,38
Acétonitrile
0,65
n-hexane
0,01
Chloroforme
0,40
Méthanol
0,95
CCl4
0,18
Dioxane
0,56
Éthanol
0,88
1-chlorobutane
0,26
Tetrahydrofurane
0,57
Ethylène
glycol
1,11
Ether
isopropylique
0,28
Acétate d’éthyle
0,58
eau
élevée
Ordre d’élution des composés
– Paraffines
– Oléfines
– Hydrocarbures aromatiques
– Halogénures, sulfures
– Éthers
– Dérivés nitrés
– Esters, aldéhydes, cétones
– Alcools, amines
– Sulfones
– Sulfoxydes
– Amides
– Acides carboxyliques
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4- Chromatographie de partage
4-1-Généralités
Peut être subdivisée en deux
– Chromatographie liquide/liquide (applications marginales)
• Phase stationnaire retenue par adsorption sur le support
– Chromatographie liquide/phase greffée (majorité des applications)
• Phase stationnaire liée chimiquement au support
Support : à base de silice
• Particules uniformes
• Particules poreuses et mécaniquement stables
• Particules de diamètre de 3, 5 ou 10 µm
• Surface entièrement hydrolysée
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Les phases stationnaires (Obtenues par réaction de silanisation)
• Réaction d’un chlorosilane (mono, di ou tri) avec les groupements silanols
• Monochlorosilane fournit un matériel monomérique lié à la surface par une liaison
simple (liaison silyl ether)
– Les phases monomériques sont très efficaces
– Celles produits avec des di- et tri-chlorosilane sont plus robustes
• Les phases greffées sont très utilisées car elles changes la chimie de surface et donc
la sélectivité
21
Les phases mobiles
– Classées selon leur polarité:
indice de polarité de Snyder (P’) basée sur des mesures de solubilité
de la substance étudiée dans 3 solvants
– Dioxane (accepteur de proton à faible moment dipolaire)
– Nitrométhane (accepteur de proton à moment dipolaire élevé)
– Éthanol (donneur de proton à moment dipolaire élevé)
Solvant
P’
Solvant
P’
Solvant
P’
Fluoroalcanes
<-2
Toluène
2,4
Dioxane
4,8
Cyclohexane
0,04
Ether éthylique
2,8
Méthanol
5,1
n-hexane
0,1
Tetrahydrofurane
4,0
Acétonitrile
5,8
1-chlorobutane
1,0
Chloroforme
4,1
Nitrométhane
6,0
CCl4
1,6
Ethanol
4,3
Ethylène glycol
6,9
Ether isopropylique
2,4
Acétate d’éthyle
4,4
eau
10,2
22
4-2- Chromatographie à polarité de phase normale (NP)
Définition: la chromatographie en phase normale utilise une phase stationnaire plus
polaire que la phase mobile
– Phase stationnaire: silice greffée cyano, diol et amino
– Phase mobile: hexane, chloroforme, ethylacétate
• Les analytes polaires sont retenus plus longtemps dans la colonne que les composés
moins polaires
• Le groupe le plus polaire guide la rétention












CH3 : les moins retenus
Aromatiques : rétention plus
forte du fait des électrons 
Halogènes : moment dipolaire
Ether
Nitro
Ester
Aldéhyde
Cétone
Alcool : liaisons hydrogène
Amine
Amides
Acides
la polarité du solvant augmente dans le sens de la flèche
PHASE
NORMALE
adsorbant
polaire et
très
polaire
la polarité
de
l'échantill
on
augmente
Optimisation de la phase mobile
Différents solvants peuvent modifier la sélectivité
– Utilisation de nomographe
Exemple
– Élution par 92% n-pentane – 8% methylacétate
• Faible sélectivité
• Durée correcte
– Remplacement par
• 62% n-pentane 38% methylènechloride
24
4-3- Chromatographie à polarité de phase inversée (RP)
Définition : la chromatographie en phase inverse utilise une phase
stationnaire moins polaire que la phase mobile
– Phase stationnaire est hydrophobe et liée chimiquement à un support de
silice: octadecylsilyl (C18), octylsilyl (C8) et C4
– Phase mobile: eau, acétonitrile, méthanol, THF, tampons
la polarité du solvant augmente dans le sens de la flèche
PHASE
INVERSÉE
adsorbant
peu polaire
la polarité
de
l'échantillon
augmente
25
L’eau est le solvant le plus faible car il est le plus polaire
- repousse les analytes hydrophobes vers la phase stationnaire
- les temps d’analyse sont longs
Le modificateur est moins polaire que l’eau
- l’analyte est moins repoussé vers la phase stationnaire
- temps de rétention plus faible
Plus on ajoute de modificateur plus les temps de rétention sont courts
Changer le modificateur change la sélectivité et la rétention (changement de polarité)
Changer le modificateur change la sélectivité et la rétention
(changement de polarité)
Utilisation d’un nomographe
– Permet de sélectionner un autre solvant
– Pour une durée d’élution à peu près identique( isoéluotropique)
– Pour une sélectivité différente
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Rétention en chromatographie de phase inverse
Le caractère hydrophobe est le premier indicateur d’une rétention
– le caractère hydrophobe s’exprime par log P (partition entre eau – octanol)
– plus log P est grand plus le composé est hydrophobe
L’ordre d’élution est gouverné par la solubilité et le nombre d’atome de carbone
– moins le composé est soluble, plus la rétention est grande
– la rétention augmente avec le nombre d’atomes de carbone
– les composés ramifiés sont élués plus rapidement que leurs isomères linéaires
– les insaturations diminuent la rétention
L’ordre général d’élution est:
– les espèces ioniques sont élués avec les volumes vides
– acides forts
– acides faibles
– bases faibles
– dipôles permanents
– dipôles induits
– aliphatiques
Rétention croissante
Solubilité dans l’eau croissante
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5- Les modes de travail
Mode isocratique
– la composition de la phase mobile reste
inchangée
– Certains problèmes peuvent survenir
• grande diversité de polarité des analytes
• temps d’élution long
• mauvaise sensibilité pour les composés
très retenus car les pics sont larges
• possibilité de rétention irréversibles
conduisant à des contaminations
Mode à gradient d’élution
– la composition de la phase mobile change au
cours de l’analyse
– la composition initiale est choisie pour
séparer les composés les plus rapidement
élués
– la force d’élution est augmentée pour éluer
les composés avec une sélectivité optimum
– la composition finale est choisie pour éluer
l’ensemble des composés dignes d’intérêt
– il est possible d’augment la force éluante
pour éliminer les composés très retenus
pouvant conduire à des contaminations
30
Phase normale
( LC-NP)
Phase inverse
(LC-RP)
Gradient
d’élution
Polarité croissante de l’éluant
Polarité décroissante de l’éluant
Exemple
Hexane
+ proportion croissante
d’acétate d’éthyle
Eau
+ proportion croissante
d’acétonitrile
Ordre d’élution Les solutés les moins polaires
sont les plus rapides
Les solutés les plus polaires sont
les plus rapides
6- Optimisation


L’efficacité a une grande influence sur la résolution
Les paramètres ayant une influence sur l’efficacité sont
 Longueur de la colonne (doubler la longueur double N)
 Taille des particules dP
 Volume vides
H min  3  d p u opt ( cm .s 1)  0 ,5
d p ( µm )
 Débit
32
La sélectivité a une grande influence sur la
résolution
Les paramètres ayant une influence sur la
sélectivité sont
 La phase mobile
 La température
 La phase stationnaire
Le meilleur moyen de modifier la rétention est de
changer la force du solvant
– une augmentation de 10% du modificateur
diminue k d’un facteur 2 ou 3
– Le gain maximal de la résolution est quand k est
compris entre 1 et 5
Exercice d’application :
Les facteurs de rétentions de 2 solutés sur une colonne C18 (L = 15 cm ; dC = 4,6 mm;  = 70% )
sont respectivement 0,96 et 1,07 ;
La phase mobile est un mélange H2O/MeOH 40/60 ; Le temps mort est tm = 2,3 min
On décide de doubler la longueur de colonne en conservant le même débit ;
A ) Déterminer :
- Le volume mort de la colonne
- Les temps de rétention et le temps mort du système
- Les facteurs de rétention
V 'm
  dc 2
 
 4

donc
t'm 
Vm '  2 .Vm  2
V 'm
D
k'  k car
donc

 .  .L'



2 Vm
D
k K
avec
 ( 4 , 6 . 10
L'  2 .L
3 2
)
4
x 0 ,15 x 0 , 70  3,5 . 10
6
m
3
 3,5 .mL
 2 .t m  4 , 6 . min
VS
VM
or K ne dépend que de la température
VS et VM augmentent dans les mêmes proportions
t'R 1  t'm ( 1  k 1 )  4 , 6 x ( 1  0 , 96 )  9 . min
t'R 2  t'm ( 1  k 2 )  4 , 6 x ( 1  1, 07 )  9 ,5 . min
B ) Comment vont évoluer les paramètres suivant :
- La sélectivité
- L’efficacité
- La résolution
' 
k'2
N' 
k2

k'1
L'
H'
 
k1

2L
H
donc sans effet sur la sélectivité
 2N
la longueur est doublée mais la hauteur reste constante
car le débit est constant
En utilisant la relation d’approximation pour la résolution
RS 
1
2
x
N x
 1
 1
x
k
or k et  sont constants
1k
RS  A
On peut donc écrire RS sous la forme
R'S  A
N' A
2N 
2A
 Augmentation de RS de 41 %
N 
N
2 RS  1,41x RS
7- La chromatographie de surface ou planaire
•
•
•
•
Elle peut se faire
– Sur papier
– Sur couche mince (plaque d’aluminium ou de verre sur laquelle est
déposée la phase stationnaire)
Elle exploite les phénomènes:
– D’adsorption
– De partage
– D’échange d’ions
La phase stationnaire
– Silice, alumine, cellulose
– Plus un composé est polaire plus il sera fortement adsorbé
La phase mobile
– Solvants plus ou moins polaires purs ou en mélange
– Plus l’éluant est polaire plus les composés se déplacent rapidement
36
CCM (Chromatographie sur Couche Mince)
Principe: adsorption
– La phase stationnaire solide est fixée sur un support adsorbant inerte.
– La phase mobile, non miscible avec la phase stationnaire, migre par capillarité.
Révélation
–
–
•
UV
Diiode, permanganate, ou autres réactifs chimiques spécifiques
Rapport frontal Rf
Rf 
distance
distance
•
H
hi
•
Résolution R
Efficacité N
parcourue
parcourue
par le soluté

par le solvant
R  2
hi
( toujours  1)
H
h 2  h1
 2  1
 h
N  16   i
 i




2
37