Transcript Les méthodes séparatives: la chromatographie
Les méthodes séparatives: la chromatographie
I Introduction II- Chromatographie sur colonne : aspects généraux III- La chromatographie liquide haute performance (HPLC) III- La chromatographie en phase gazeuse (CPG) IV- La chromatographie d’exclusion stérique (SEC) V- Analyse quantitative 1
I- Introduction
• •
1- Historique
En 1906, un botaniste russe Mikhail Semenovich TSWETT (1872-1919) purifie des pigments végétaux, comme la chlorophylle, sur une colonne de craie. Il donne alors à ce phénomène de séparation le nom de
chromatographie
(du grec
khrôma
, couleur et
graphein
, écrire) qu’il définit comme l’enregistrement graphique des couleurs. On assiste alors à la naissance de la chromatographie . En 1952, les biochimistes A. J. P Martin et R. L. M. Synge reçoivent le prix Nobel de chimie pour leur contribution au développement de la chromatographie moderne.
• La chromatographie à connu un essor important durant ces 50 dernières années dont l’origine tient, dans une large mesure, au fait que se trouvent associés une
méthode séparative rapide et performante couplée à des détecteurs sensibles et variés
.
Aujourd’hui chromatographie préparative chromatographie analytique 2
2- Définition : IUAPC
(International Union of Pure and Applied Chemistry)
• La chromatographie est un procédé physico-chimique de séparation d’un mélange homogène liquide ou gazeux. Le principe repose sur l'équilibre de concentrations des composés présents entre deux phases en contact : la
phase stationnaire
et la
phase mobile
qui se déplace. La séparation est basée sur l'entraînement différentiel des constituants du mélange.
La phase stationnaire
est une phase qui reste en place, soit dans une colonne, soit sur une surface plane.
La phase mobile
est une phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, entraînant l’analyte avec elle.
L'élution
est un processus au cours duquel les analytes sont entraînés à travers une phase stationnaire par le mouvement d’une phase mobile.
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3- Classification
Selon la technologie mise en œuvre
–Chromatographie
sur colonne
–Chromatographie
de surface
:sur papier ou sur couche mince (CCM)
Selon la nature des phases
–
Selon la nature de la phase mobile on distingue:
•la chromatographie en phase liquide
CPL
•la chromatographie en phase gazeuse
CPG
•la chromatographie en phase supercritique
CPS
–
Selon la nature de la phase stationnaire on distingue:
•la chromatographie gaz / solide
CGS
•la chromatographie gaz / liquide
CGL
•la chromatographie liquide / solide
CLS
•la chromatographie liquide / liquide
CLL Selon la nature des phases phénomènes mis en jeu dans la séparation
•
La chromatographie d’adsorption
basée sur les processus répétés d’adsorption/désorption par la phase stationnaire (solide) •
La chromatographie de partage
basée sur les différences de solubilité des molécules entre la phase stationnaire (liquide) et la phase mobile •
La chromatographie d’échange d’ions
ionisé ou ionisable Échange entre une phase stationnaire ionisée et un soluté •
La chromatographie d’exclusion
basée sur la séparation des molécules en fonction de leur taille •
La chromatographie d’affinité
Il s’agit là d’une association entre une molécule polyfonctionnelle et une phase stationnaire comportant des sites stériquement définis et de capacité d’échange multiple 4
4- Les interactions. Les forces intermoléculaires
Forces de dispersion de London
-
interaction entre dipôles instantanés - interaction présente dans tous les composés -n’intervient qu’à courte distance -augmentent avec la
polarisabilité
des molécules d + d -
Molécules apolaires
d + d -
Forces de Keesom -
attraction entre dipôles permanents
d d +
Molécules polaires
d +
Forces de Debye -
interaction entre dipôles permanents et dipôles instantanés ( ou induits )
Liaison hydrogène :
- attraction de type Keesom entre un H lié à un atome électronégatif et un autre atome électronégatif - interaction à plus longue distance
XH
donneur X et Y = F, O ou N
l Y
accepteur
Forces de London Forces de Debye Forces de Keesom Liaisons hydrogène Interactions ioniques
Énergie de « liaison »
Ordre de polarité des molécules
- Hydrocarbures R-H alcanes alcènes aromatiques - Composés halogénés R-X - Ethers ROR’ - Dérivés nitrés RNO 2 - Esters RCOOR’ - Dérivés carbonylés aldéhydes RCHO cétones RCOR’ - Alcools ROH - Amines RNH 2 - Dérivés d’acides carboxyliques amides RCONHR’ nitriles RCN acides RCOOH - Eau H 2 O
• • Le partage des analytes est donc guidé par leurs interactions avec chacune des deux phases. Plus l'analyte interagit avec la phase stationnaire, plus son élution sera longue.
Forces de dispersions Dipôle instantané/ dipôle instantané Interactions dipôle/dipôle Dipôle : permanent/permanent permanent/induit
0,5 à 10 kJ.mol
-1 Toutes les molécules Molécules polaires Molécules possédant des e p
Liaisons hydrogène Interactions diélectriques
8 à 40 kJ.mol
-1 40 à 85 kJ.mol
-1 Molécules possédant des H labiles Ions 6
II- Chromatographie sur colonne: aspects généraux
– Le processus chromatographique – Le chromatogramme et les pics chromatographiques – Les grandeurs fondamentales de la chromatographie – La relation fondamentale 11
1- Le processus chromatographique
– La phase mobile est continuellement introduite sur la colonne – L’échantillon est introduit sans arrêter le flux de phase mobile – Les solutés se répartissent entre les deux phases – Les composés sont élués en fonction de leur affinité vis-à-vis des phases – Les solutés sont détectés en sortie de colonne par le détecteur K A C A stationnai re C A mobile
(K A
≥
1)
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2- Le chromatogramme et les pics chromatographiques
• Le résultat de l’analyse est le chromatogramme (ensemble de pics) • Le pic chromatographique représente la distribution statistique des temps de transit du composé dans la colonne :
c’est une courbe de Gauss
( en chromatographie idéale )
– Moyenne : temps de rétention – Variance ² : liée à l ’étalement de l ’arrivée des molécules Le temps de rétention est une grandeur qualitative :il est identique pour des conditions identiques L’aire ou la hauteur est une grandeur
quantitative
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W : largeur du pic à une ordonnée déterminée
W
2
a
2
A la base
W
4 1 , 7 d
A la mi-hauteur
W
d 5 , 54 2 , 36 0 , 59
Isothermes de distribution :
A: situation idéale pic gaussien B : situation dans laquelle la phase stationnaire est saturée C : situation inverse dans laquelle le constituant est trop retenu dans la phase stationnaire
Facteur de traînée
: F t = b/a A : F t = 1 ; B : F t > 1 ; C : F t < 1
3- Les grandeurs de rétention
• • •
Temps de rétention: Le temps de rétention t R
: temps écoulé entre l’instant de l’injection et celui déterminé au maximum du pic
Le temps mort t m
(ou t 0 ) : temps de rétention d’un composé non retenu par la colonne
Le temps de rétention réduit t R ’
: différence entre temps de rétention et temps mort
t R ’ = t R - t m
t m t R t ’ R temps
Expression du temps mort:
Vitesse linéaire t M L u L D .
s Longueur Débit Section Porosité Top d ’ injection Pic de l ’ air Pic de solut é 16
Volumes de rétention :
o composé : o
Le volume de rétention V R V R Le volume mort V m
: volume de phase mobile nécessaire à l’élution du
= t R x D
: volume de phase mobile nécessaire à l’élution d’un composé non retenu par la colonne = volume de phase mobile dans la colonne = volume interstitiel accessible =
V M
o
V M = V 0 = t m x D = t 0 x D
Le volume de rétention réduit : différence entre volume de rétention et volume mort
V R ’ = V R – V M
o On démontre que : V
R = V M
avec V S
+ K V S
= volume de phase stationnaire
Le temps de rétention dépend
Du couple soluté-phase stationnaire en CPG Du triplet soluté-phase stationnaire-phase mobile en CL Du débit de la phase mobile De la masse de phase stationnaire dans la colonne De la température de la colonne De la longueur de la colonne
Le temps de rétention ne dépend pas
De la quantité de soluté injecté De la nature et de l ’abondance des autres constituants De la nature de la phase mobile en CPG
•
4- Les grandeurs de rétention relatives
Facteur de rétention ou facteur de capacité k
Il décrit la vitesse de progression d’un soluté dans la colonne – une valeur de k élevée indique que le composé est fortement retenu par la colonne et qu’il passe un temps significatif à interagir avec la phase stationnaire – Les chromatographistes essaient d’avoir des valeurs de k comprises entre 1 et 10 [soluté dans phase stationnaire] Volume de phase stationnaire
k
m S m M
C S C M
V S V M
K V V M S
V R V m
'
t t m
'
R
k est indépendant
De faibles variations de débit
t R
Des dimensions de la colonne
t
0 1 +
k
t m (1
+
k)
[soluté dans phase mobile] Volume de phase mobile
V R
V
0
1
+
k
V m (1
+
k)
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Exercice d’application :
Exprimer le temps d’analyse , assimilable au temps de rétention du composé le plus retenu en fonction de la longueur de colonne L , de la vitesse de la phase mobile u et des volumes de phase mobile V M et de phase stationnaire V S dans la colonne
5- L’efficacité : Nombre d’étages théoriques N
Le nombre d’étages théoriques mesure la dispersion de l’analyse lors de sa traversée de la colonne Les équilibres sur la colonne - Analogie avec une colonne à distillée 64 mg de A K=1 5 équilibres 5 Plateaux 20
N L L 2 t R 2
N
t
R
2 16
t R
2 5 , 54
t
d
R
2 N dépend De la nature de la colonne (capillaire ou remplie) De la qualité de la préparation de cette colonne De la façon dont elle est employée
La hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT)
L = longueur de la colonne HEPT L N
La théorie des plateaux néglige le passage continue de la phase mobile sur la phase stationnaire Ce passage produit un élargissement ou un rétrécissement des pics Giddings lie la HEPT à des paramètres qui dépendent de la vitesse de la phase mobile
Equation de Van Deemter
H
HEPT
A
+
B
+
Cu u
A
= diffusion turbulente due à l’écoulement irrégulier de la phase mobile à travers la phase stationnaire (particules plus ou moins régulières) • indépendant du débit • ne dépend que des particules ( quand le diamètre )
B
= diffusion longitudinale, rend compte de la diffusion des molécules dans la direction de l’écoulement • d’autant plus important que la vitesse est faible
B
2
D m
Dm coefficient de diffusion dans la phase mobile ; tortuosité
C
= transfert de masse représente les inégalités de passage des molécules d’une phase à l’autre •Toutes les molécules ne sont pas entraînées à la même vitesse •Le contact entre phase mobile et phase stationnaire ne s’effectue pas partout de manière identique •Le molécules de solutés dans la phase stationnaire sont situées à des distance variables de la phase mobile
u
= vitesse de la phase mobile , dépend de : •La température •La pression •La colonne
u opt B C
6- Le facteur de sélectivité :
• • Décrit la position de 2 pics adjacents situés sur un chromatogramme. Il est toujours supérieur à 1.
représente la capacité qu’à une colonne à séparer chimiquement deux composés Équilibre
C
S
C
M G 0 RT ln K RT ln C S C M
G
2 0
G
1 0 -
RT
ln
t
'
R
2
t
'
R
1
k
2
k
1
K
2
K
1 '
t R
2 '
t R
1 > 1 24
7- Le facteur de résolution Rs
• Donne la mesure quantitative de l’aptitude d’une colonne à séparer deux solutés R S 2 t R 2 2 + t R 1 1 2 t ' R 2 2 + t ' R 1 1 :largeur du pic à la base 25
Exercice d’application :
Exprimer Rs en fonction des largeurs des pics à mi-hauteur
8- Relation fondamentale
Relation de PURNELL
R 1 4 x N 2 x 1 x 1 k ' + 2 k ' 2
Relation d’approximation
Terme cinétique R 1 2 x N x + 1 1 x 1 k ' + k ' Terme thermodynamique
k
k
1 +
k
2 2
N
N
1 +
N
2 2 27
Exercice d’application :
A ) Montrer que l’expression de Purnell est équivalente à celle de la définition chromatographique de Rs lorsque les 2 pics ont des largeurs égales ( 1 = 2 )
B ) Montrer que la relation d’approximation est équivalente à celle de la définition chromatographique de Rs lorsque les 2 pics ont des efficacités égales (N 1 = N 2 )