Transcript PCR в реално време - в търсене на вируси, мечки, генно

PCR в реално време - в търсене на
вируси, мечки, генно
модифицирани храни и гени
Олга Белчева и Гюлназ Джебир
12.06.2012
Център по молекулна медицина
За какво ще говорим днес
Целта на заниманията ни днес е да разберем:
 що е то PCR в реално време;
 какви са предимствата му пред „традиционния” PCR;
 какви методи се използват за провеждането му;
 за какво може да ни послужи.
PCR
Въз основа на данните получени от различните
проекти за секвениране на човешкия геном е
пресметнато, че всяка наша клетка съдържа около 3
млрд. б.д. ДНК или 10-25 000 белтък кодиращи гена. В
повечето случаи ние се интересуваме от конкретни
полиморфни варианти, екзони, регулаторни участъци
или гени, а не от целия геном – работата ни е да
открием игла в купа сено.
Полимеразната верижна реакция, PCR, ни позволява
да намножим точно този участък, който ни интересува.
Целта на PCR и PCR в реално време е една и съща – да
получим смес от ДНК молекули, в която концентрацията
на интересуващата ни нуклеотидна последователност е
многократно по-голяма от тази на всички останали
секвенции.
PCR – ход на реакцията
3
1
2
Какво става с нашата секвенция?
цикъл
ДНК молекули
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
...
...
33
8 589 934 592
34
17 179 869 184
35
34 359 738 368
Какво става с нашата секвенция?
Теоретично, броят на новите копия нараства в геометрична
прогресия.
На
практика
след
определен
етап
нарастването се забавя,
поради изчерпване на
реактивите,
паралелно
разграждане
на
вече
синтезирани фрагменти,
„изтощаване” на ензима,
и т.н.
цикъл
цикъл
ДНК
ДНК молекули
молекули
прогресия
прогресия
1
2
=1*21
2
4
=1*22
3
8
=1*23
4
16
=1*24
5
32
=1*25
6
64
=1*26
...
...
…
33
8
1 589
109 934 592
33
32,36
=1*2
=1*2
34
17
179 934
869 592
184
1 189
34
32,48
=1*2
=1*2
35
34
359 934
738 592
368
1 209
35
32,60
=1*2
=1*2
Какво става с нашата секвенция?
Така, ако искаме да преценим с колко копия сме започнали е найдобре да засечем продукта преди реакцията да се е забавила, т.е.
преди графиката на зависимостта на броя копия от броя цикли да е
достигнала плато. В този случай се интересуваме от т.нар.
експоненциална част на графиката.
1400000000
ДНК копия
1200000000
1000000000
800000000
600000000
400000000
200000000
0
1
6
11
16
21
бр. цикли
26
31
36
Ако започнем с повече?
ДНК молекули
цикъл
започваме с
една
започваме с
две
1
2
4
2
4
8
3
8
16
4
16
32
5
32
64
6
64
128
7
128
256
8
256
512
...
...
...
Ако започнем с повече?
1400000000
ДНК копия
1200000000
1000000000
800000000
600000000
400000000
200000000
0
1
6
11
16
21
бр. цикли
26
31
36
Малко математика
бр. цикли
бр. ДНК молекули
1
2
2
4
3
8
4
16
5
32
...
...
33
1 109 934 592
34
1 189 934 592
35
1 209 934 592
Разликата в броя ДНК
молекули в началото на
реакцията и към края й е
огромно, което прави част
от графиката „невидима”.
За
това,
вместо
да
отчитаме какъв е броят на
копията в края на всеки
цикъл,
можем
да
пресметнем степента на
нарастването
като
използваме логаритмична
функция.
22=4
log24=2
Малко математика
бр. цикли
бр. ДНК молекули
Log2 бр.
ДНК молекули
1
2
1,00
2
4
2,00
3
8
3,00
4
16
4,00
5
32
5,00
...
...
…
33
1 109 934 592
30,05
34
1 189 934 592
30,15
35
1 209 934 592
30,17
Малко математика
log2 ДНК копия
35.00
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
1
6
11
16
21
бр. цикли
26
31
36
За различен брой копия от
матрицата...
log2 ДНК копия
35.00
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
1
6
11
16
21
бр. цикли
26
31
36
Малко математика
бр. цикли
бр. ДНК молекули
Log10 бр.
ДНК молекули
1
2
0,30
2
4
0,60
102=100
3
8
0,90
4
16
1,20
log10100=2
5
32
1,51
...
...
…
33
1 109 934 592
9,05
34
1 189 934 592
9,07
35
1 209 934 592
9,08
lg100=2
Малко математика
Ако използваме десетичен логаритъм, скалата на ординатата
ще намалее още по-вече – графиката се “снижава”.
10.00
30.00
log10 ДНК копия
log2 ДНК копия
35.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
8.00
6.00
4.00
2.00
0.00
0.00
1
6
11
16
21
бр. цикли
26
31
36
1
6
11
16
21
бр. цикли
26
31
36
PCR срещу Real-time PCR
Разликата между PCR и PCR в реално време е в това какво
получаваме накрая.
PCR ни дава това:
PCR в реално време това:
1400000000
ДНК копия
1200000000
1000000000
800000000
600000000
400000000
200000000
0
1
6
11
16
21
бр. цикли
26
31
36
PCR срещу Real-time PCR
Двата метода ни позволяват да отчетем резултатите в
различен етап от амплификацията.
PCR ни дава възможност да видим продукта на последния
цикъл – момента когато реакцията е достигнала плато.PCR
ДНК копия
PCR в реално време ни позволява да видим как се
1400000000
увеличава броя на копията на нашия продукт през цялото
1200000000
време на реакцията. По този
начин PCR
можем да отчетем
Real-time
1000000000
реалните разлики
в началните количества на матрицата в
800000000
различните проби.
600000000
400000000
200000000
0
1
6
11
16
21
бр. цикли
26
31
36
TaqMan проби за Real-time PCR
Визуализацията на продуктите от първия цикъл на
реакцията, когато те са малко на брой, може да се
постигне
чрез
флуоресцентно
белязване.
Една
възможност е използването на TaqMan проби.
Това са олигонуклеотиди, комплементарни на участък
между двата праймера. В 5’ края му е разположен
флуорофор, а в 3’ края т. нар. затихвател (quencher).
Когато върху пробата попадне лазерен лъч, високо
енергийния флуорофор поема фотона, но ниско
енергийния затихвател подтиска светенето му. В хода на
амплификацията полимеразата започва да добавя
нуклеотиди към 3’ края на праймера, а когато наближи
пробата я разгражда (5’>3’ екзонуклеазна активност).
Разпадането на пробата раздалечава флуорофора от
затихвателя, в резултат на което той започва да свети.
TaqMan проби за Real-time PCR
В реакцията присъстват:
 ДНК матрица;
 праймери за интересуващата ни секвенция;
 флуоресцентно белязана проба;
 Taq полимераза.
Приложение на TaqMan пробите
Съществуват
две
основни
приложения
на
флуоресцентно белязаните TaqMan проби за PCR в
реално време:
 количествен анализ – определяне на брой копия от
дадена секвенция;
 алелна дискриминация – разграничаване на два (или
повече) варианта на една и съща секвенция.
За нуждите на количественият анализ използваме
факта, че TaqMan пробите ни позволяват да отчетем
броя
на
ново
синтезираните
фрагменти
през
експоненциалната фаза на амплификацията.
Когато трябва да различим алели, използваме проби,
които са комплементарни на съответните варианти и са
белязани с различни фолуорофора.
Количествен анализ с TaqMan
Техниката PCR в реално време най-често се използва
за определяне на количеството (брой копия) на дадена
секвенция. Нарастването на флуоресценцията с всеки
изминал цикъл от експоненциалната фаза е право
пропорционално на увеличението на броя копия на
продукта.
Съществуват два варианта на количествен анализ:
 абсолютен – измерва се точния брой копия от дадена
нуклеотидна последователност;
 относителен – определя се колко пъти повече/по-малко е
дадена последователност в сравнение с референтна такава.
Абсолютен количествен анализ
Точното определяне на количеството на интересуваща
ни секвенция става с помощта на стандартна крива, за
построяването на която се използват серийни разредки
на
проба,
съдържаща
предварително
известни
количества от същата последователност.
В хода на PCR реакцията се отчита флуоресценцията
на всяка от разредките и се построява графика на
зависимостта на светенето от концентрацията им. Така
построената графика се използва за да се определи на
каква
концентрация
съответства
измерената
в
неизвестната проба флуоресценция.
Построяване на стандартна крива
флуоресценция на
неизвестна проба
флуоресценция
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
1/1000
1/100
1/10
концентрация
1
10
Относителен количествен анализ
Друг начин за извършване на количествен анализ е чрез
нормализиране на пробите с помощта на вътрешна контрола.
Такъв тип експериментална постановка се използва например
за сравняване на нивата на транскрипция на един ген в
различни типове клетки. Вътрешната контрола най-често е bактин или глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, за които се
знае, че се експресират еднакво във всички клетки.
За всяка проба се използват два различно белязани TaqMan
олигонуклеотида, съответно за изследвания ген и за
контролата. Стойностите на флуоресценцията получени за
контролата се използват за да се нормализират резултатите
получени за интересуващия ни ген. В крайна сметка се
получава сравнителна стойност, напр. колко пъти експресията
на гена в клетки тип А надвишава тази в клетки тип Б.
Относителен количествен анализ
Алелна дискриминация с TaqMan
С помощта на PCR в реално време, използвайки TaqMan
проби, можем да докажем присъствието на полиморфни
варианти в дадена секвенция. Пример за това е SNP
генотипирането, което има за цел да определи дали в
дадена проба присъстват две копия на алел 1, две копия
на алел 2 или по едно копие от двата.
След края на тези безкрайно дълги обяснения ще
имате възможност да изпробвате това на практика!
Алелна дискриминация с TaqMan
Резултатът е представен графично като може да видим
едновременно генотипите на всички анализирани проби:
или за всяка проба по отделно:
хомозигот
хетерозигот
SYBR Green или TaqMan
TaqMan
пробите
не
са
единственият
начин
за
проследяване
хода
на
PCR
реакции. Различни фирми са
разработили различни техники
за визуализация на резултатите
от PCR в реално време (напр.
Scorpions,
Molecular
beacon).
Една много често използвана
алтернатива е багрилото SYBR
Green.
Молекулите
на
багрилото
интеркалират с ДНК – когато се
закачат за малката бразда на
двойно верижните спирали те
започват да флуоресцират.
SYBR Green или TaqMan
Какви са предимствата и недостатъците на SYBR
Green?
 Предимства:
 универсален маркер - не изисква специфични проби;
 по-евтино – един и същи реактив може да се използва за
различни PCR реакции;
 по-висока чувствителност - много флуорофорни молекули
се закачват към продукта.
 Недостатъци:
 провеждането
на
алелна
допълнителна оптимизация;
дискриминация
изисква
 риск от фалшиво-положителен резултат (може да бележи и
неспецифични продукти).
Приложение
За какво бихме могли да използваме PCR в реално
време? Най-често срещани са следните приложения на
този метод:
 идентификация на индивиди;
 еволюционни проучвания;
 количествен анализ;
 търсене на патогенни мутации;
 търсене на нови гени или генетични елементи свързани
със заболявания при човека;
 ...
Идентификация на индивиди
Еволюционни проучвания
Количествен анализ
Търсене на патогенни мутации
Търсене на патогенни мутации
Търсене на нови гени
Търсене на нови гени
Въпроси?