Transcript ภาพนิ่ง 1

การตรวจหา Diatom มีการศึกษาในกรณีที่มีการจมน้าตาย ด้ วยการย่ อ ยของ
Enzyme Proteinase K โดยการใช้ Formalin ช่ วยในการรักษาสภาพ
ของเนื้อเยื่อปอด ซึ่ ง Formalin
เป็ นตัวช่ วยอีกทางหนึ่ง ที่สามารถลดการติ ดเชื้อที่
ก่ อให้ เกิดโรค นอกจากนีย้ ังศึกษาผลกระทบของ Hydrogen peroxide โดยที่
เนื้อเยื่อถูก Fixed
ด้ วย Formalin ที่ความเข้ มขึน้ 0.01 โมล มี TrisHCL (pH7.5) มีส่วนประกอบของ Sodium dodecyl sulfate
(SDS) (สารที่ทาให้ เป็ นกลางไม่ ให้ เนื้อเยื่อเกิดการย่ อยสลาย) อาจจะมีหรื อไม่ มี
Glycine ที่เวลา 6 และ 12 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 80 องศา ใน Incubator
แล้ วนาไปตรวจวิเคราะห์ ไดอะตอมทั้งเชิงปริมาณและเชิงคุณภาพ
Diatoms ?
(Kingdom Protista)
Coscinodiscus.
Asterionella.
(Divition Bacillariophyceae)
เป็ นกลุ่ม monophyletic, single cell,
Photosynthetic มีลกั ษณะตามผนังเซลล์ทไี่ ม่
ซ้ากันของซิลกิ า,
Frustule เป็ น 2 ส่ วน
- เหมือนจานและฝาที่ทับซ้ อนกัน
- มีเซลล์ ทอี่ ยู่ภายใน Ex. Chloroplasts…
Cymatopleura.
Structure of diatom.
Frustule –ส่ วนที่ 1 (Epitheca) ส่ วนบน –ส่ วนที่ 2 (Hypotheca) ส่ วนล่าง
Centrate
Pennate
ภาพชิ้นส่ วนทั้งสอง Frustule
Diatoms
Diatoms centrate.
- Centrobacillariophyceae
เป็ นปกติ radially สมมาตร เช่น Melosira.
Diatom pennate.
- Pennatibacillariophyceae แสดง
สมมาตรสองข้าง เช่น Pinnularia.
2.1 ใช้ ตวั อย่ างของเนือ้ ปอดที่ Unfixed หรือ Fixed-formalin ใน 6 กรณีของการจมนา้ ตาย
ตารางที่ 1 กรณีการจมนา้ ตาย
Case
Age
Body
Body
Sex
hight(cm) weight(kg)
1
48
M
182
2
42
M
3
84
4
Lung weight
PIM
Left (g)
Right
(g)
100
540
581
0.5-1M
168.5
71
549
651
2-4 D
F
145.5
35
436
421
1.5-2 D
61
F
155.5
48
410
501
3-5 D
5
28
M
172.3
75
532
566
1-2 W
6
70
M
168.5
58.5
539
793
1.5-3 D
PIM : ช่ วงระยะเวลาของการตาย
2.2 Enzymatic digestion of fixed or unfixed tissue.
10 g block of formalin-fixed lung
tissue.
The sample was heated at 100°C in 100 ml of 0.01 M Tris–
HCl buffer (pH7.5) containing 2% SDS (tissue lysisbuffer), with or without 0.2 M glycine for 6 h.
Sample added to 500 ml of 10 mg/ml proteinase K and
shaken gently at 50 °C overnight.
Thereafter, 500 ml. of proteinase K solution and
100 ml. of distilled waterwas added and
incubated at 50 °C with gentle shaking overnight.
Sample was centrifuged at 3000 rpm. for 15 min,
and the upper layer was removed.
NOTE.
For enzymatic digestion of unfixed lung, 10 g. of
tissue was minced, mixed with tissue lysis-buffer
and 500 ml. of 10 mg/ml proteinase K, and
subsequently processed as heated formalin-fixed lung
tissue.
2.3 Effect of hydrogen peroxide on contamination and
Diatoms.
Sediment was incubated with two volumes
of hydrogen peroxide at 80°C
6 Hour.
12 Hour.
Centrifuged at 3000 rpm. for 15 min, and
the upper layer was removed.
Sediment with or without incubation with
hydrogenperoxidewas transferred on to
a coverglass, mounted in Mountmedia.
Examined under a light microscope
equipped with an objective (200).
2.4 Comparison of the number and proportion of
diatoms between fixed and unfixed lung.
ตารางที่ 2 แสดงการวิเคราะห์ ปริมาณของ Diatom ในเนือ้ ปอดที่ Formalin fixed และ
Unfixed
Case
Fomaline–fixed lung
Centric
Unfixed lung
Pennate
Centric
Pennate
1.
711
(73%)
270 (28%)
228 (66%)
166 (34%)
2.
495 (69%)
221 (31%)
986 (65%)
526 (35%)
3.
20 (18%)
91 (82%)
11 (10%)
95 (90%)
4.
13 (44%)
17 (56%)
8 (31%)
17 (69%)
5.
5 (10%)
40 (90%)
3 (6%)
52 (94%)
6.
25 (3%)
787 (97%)
41 (3%)
1492 (97%)
3.1 Enzymatic digestion of fixed lung in tissue
lysis-buffer, with or without glycine
เนือ้ เยือ่ Fomalin–fixed ทีม่ ี Glycine buffer ละลายอยู่ (A)
ในขณะทีส่ ่ วนใหญ่ เนือ้ เยือ่ Fomalin–fixed ไม่ มี Glycine (B)
3.2. Effect of hydrogen peroxide on the contamination
and diatoms.
(รู ปที่ 2A ) ตัวอย่ างของเนือ้ เยือ่ ถูกปนเปื้ อนไปด้ วยสิ่ งแปลกปลอมสี นา้ ตาลเข้ ม
(รู ปที่ 2B ) บ่ มด้ วย Hydrogen peroxide นาน 6 ชั่วโมง วัตถุและสิ่ ง
แปลกปลอมจะเปลีย่ นไม่ มี จึงทาให้ สามารถเห็นขอบเขตขอ Diatom ชัดเจนขึน้
(รูปที่ 2 C) Diatom บ่ มด้ วย Hydrogen peroxide
ทีไ่ ด้ รับความเสี ยหายจากการบ่ มที่ใช้ เวลา 12 ชั่วโมง
3.3 Comparison of the number and proportion of the
diatoms between fixed and unfixed lung.
(รู ปที่ 2B )
(รู ปที่ 2A )
(รู ปที่ 2C )
1. จากการอ้ างอิงผลการศึกษาแสดงให้ เห็นถึงค่ าของโปรตีนจาก Electrophoresis
หรือ GC/MS ทีส่ ามารถแสดงการย้ อนกลับของเนือ้ เยือ่ FFPE ทีใ่ ห้ ความร้ อนใน
Buffer ที่มี SDS ที่มีหรือไม่ มี Glycine
2. เศษชิ้นส่ วนของเนือ้ เยือ่ ที่ Formalin – fixed ยังคงเหลือใน Buffer
ทีไ่ ม่ มี Glycine. เนือ้ เยือ่ Formalin - fixed พบว่ ายังมี
Formaldehyde หลงเหลืออยู่ ถึงจะล้ างใน Buffer หากว่ า
Formaldehyde ยังไม่ คงอยู่ในเนือ้ เยือ่ FFPE
แสดงการย้ อนกลับได้ ของ Glycine ใน การย้ อยด้ วย enzyme proteinase K
ของ Formalin fixed tissue. Formalin ส่ วนทีห่ ลวงเหลืออยู่จะยัง proteinase K
และฟอร์ มโครงกับโปรตีนทีแ่ ปลงสภาพแล้ ว โดย SDS. ส่ วนไกลซีน ใน buffer
จะป้ องกันการถูกยับยังของ proteinase K และการคืนกลับโครงข่ ายของโปรตีน
โดยกลุ่ม Formyl ของ Formadehyde
ผลของการศึกษานีแ้ นะนาตรวจหา Diatom กับการย่ อยด้ วย Proteinase K
สามารถแสดงให้ เห็นในเนือ้ เยือ่ Formalin-fixed โดยการให้ ความร้ อนแก่ ตัวอย่ าง Buffer ทีม่ ี
Glycine การศึกษานีแ้ นะนาให้ ใช้ เนือ้ เยือ่ Formalin-fixed มากกว่ าเนือ้ เยือ่ Unfixed
สาหรับการตรวจหา Diatom ในรายทีม่ คี วามเสี่ ยงต่ อการติดเชื้อ นอกจากนั้น การบ่ มการย่ อยด้ วย
Hydrogen peroxide ในเวลาทีจ่ ากัด สามารถช่ วยในการตรวจวิเคราะห์ หา Diatom ทั้ง
ปริมาณและคุณภาพในตัวอย่ างของปอดทีม่ สี ิ่ งแปลกปลอมปนเปื้ อนในการสู ดดมในรายทีจ่ มนา้ หรือภายใต้
สภาวะอืน่ ๆ