Transcript pH值對解離的影響

利用毛細管電泳分離羥基苯甲酸
: 研究 pKa 值對分離的影響
指導老師 :
林萬寅 教授
郭家銘 老師
林似津 老師
研究學生 :
一年誠班 16 彭冠嘉
一年誠班 20 楊陞
電泳簡介
• 電泳 : 利用電壓分離分析物，由於各物質的
遷移速率有差別，故電泳是分離物質的常
用方法。
利用電泳進行
DNA定序
毛細管電泳（Capillary electrophoresis）簡介
• 毛細管電泳 : 在毛細管中進行電泳，因移動
速率不同而達到分離不同分子的目的。
內徑 : 50 mm
使用長度 : 50 cm
電泳-分子量對遷移速率影響
電泳-分子帶電量對遷移速率影響
+
+ ++
+ + +
+
速率正比於
+
帶電量/質量
+
+
+
+
+
使用毛細管的優點:
1. 分離操作時間短 (最快幾秒內就完成)
2. 操作容易自動化
3. 樣品使用量少,溶劑消耗少→汙染較少
4. 分離效率高
5. 表面積大, 散熱容易
毛細管電泳分離效率高
光源(UV):分析物吸收光，有吸收度可被偵測
訊號較集中
毛細管電泳
管壁帶動
EOF(電滲透流)
壓力驅動
(一般是HPLC)
有可能和其他訊號重疊
摩擦力或附著力
壓力
偵測器
電泳示意圖
毛細管再到緩衝溶液去跑
緩衝溶液可以提供穩定的ph值
毛細管到樣品槽吸取樣品
電腦
毛細管
偵測器
+
緩衝溶液
樣品槽
+
高壓電供應
─
緩衝溶液
毛細管內的遷移
b-CD的作用原理
有一些OH的官能基會有親水性
+
Analyte
=
Cyclodextrin
羥基苯甲酸異構物
分子量：138
COOH
COOH
COOH
OH
OH
OH
解離常數
pKa1
pKa2
鄰
ortho水楊酸
2.97
4.06
4.48
9.92
9.32
間
meta-
對
para-
pH值對解離的影響
HA↔H++A-
A+B
C+D
平衡常數 K = [C][D]/[A][B]
Ka = [H+][A-]/[HA]
-log [H+] – log [A-]/[HA] = -log Ka
⇒ pH- log [A-]/[HA] = pKa
pH
-
pKa = log
[A-]
[HA]
pH值對解離的影響
pH
-
[A-]
pKa = log
[HA]
3-hydroxybenzoic acid 的 pKa1 = 4.06、pKa2 = 9.92
當 pH=6，則不帶電與帶一負電的離子比例約為 1 : 100
當pH=8， 則不帶電與帶一負電的離子比例約為 1 : 10000
帶一負電與帶二負電的離子比例約為 100 : 1
當pH=10，則帶一負電與帶二負電的離子比例約為 1 : 1
當pH=12，則帶一負電與帶二負電的離子比例約為 1 : 100
pH值的變化
p
m o
Sample: 10 ppm mix o-, m-, p-hydroxybenzoic acid
Buffer: 10 mM phosphate, + 21 kV, 200 nm
pka1 p 4.48
m 4.06
o 2.97
pH
Absorbance at 200 nm / mAU
6
7
o m
p
pka2
m 9.92
p 9.32
8
9
10
11
12
-
5
10
Migration Time / min
+
β-CD的影響
Sample: 10 ppm mix o-, m-, p-hydroxybenzoic acid
Buffer: pH 9, 10 mM phosphate, + 21 kV, 200 nm
m
o
p
[b-CD]
0 mM
Absorbance at 200 nm / mAU
1 mM
2 mM
o
m
p
3 mM
4 mM
5 mM
-
5
Migartion Time / min
10
+
結論
1.我們發現改變 pH值 會造成遷移速度
的改變甚至是異構物之間遷移順序的
改變
2.加入 b-CD 也會造成遷移順序的改變，
這可能是因為不同異構物與 b-CD 作
用力有差異所造成
心得:我學到的事
致謝
台大化學研究所
本校化學
台大化學系
郭家銘博士生
林似津老師
林萬寅教授
現在要先預祝大家…