Transcript Tải tập tin đính kèm

BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
Khóa luận tốt nghiệp
NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN
HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG
KHUẨN INVITRO CỦA VỊ THUỐC
BẠCH CẬP
Cán bộ hướng dẫn: TS Triệu Duy Điệt
Nội dung của khoá luận gồm 5 phần
• Đặt vấn đề
• Tổng quan
• Nguyên vật liệu và phương
pháp nghiên cứu
• Kết quả và bàn luận
• Kiến nghị
Đặt vấn đề
• Vị bạch cập (Rhizoma Bletillae) là thân rễ phơi hay sấy
khô của cây bạch cập Bletilla striata (Thunb) Reichb.f,
họ Lan (Orchidaceae), được dùng để điều trị một số
bệnh theo kinh nghiệm dân gian như chảy máu cam,
nôn ra máu, đau mắt đỏ, mụn nhọt sưng tấy và bỏng
lửa.
• Một số tác giả đã nghiên cứu trong vị bạch cập có chất
nhầy (khoảng 55%), một ít tinh dầu và các hoạt chất
khác chưa rõ. Tuy nhiên, thành phần hoá học và tác
dụng kháng khuẩn của vị thuốc này vẫn chưa có tài
liệu nào đề cập một cách cụ thể.
Đặt vấn đề
• Với mục đích tìm hiểu sâu hơn về thành phần hoá học
cũng như các tác dụng sinh học nói chung và tác
dụng kháng khuẩn nói riêng, nhằm phục vụ cho việc
sử dụng bạch cập trong công tác điều trị một cách
khoa học hơn.
• Chúng tôi tiến hành đề tài
“Nghiên cứu sơ bộ thành phần hoá học và tác dụng
kháng khuẩn invitro của vị thuốc bạch cập” với mục
tiêu:
– Xác định sơ bộ thành phần hoá học của vị thuốc
bạch cập.
– Đánh giá tác dụng kháng khuẩn invitro của dịch
chiết nước vị bạch cập.
Chương 1: Tổng quan
1.1 Đặc điểm thực
vật cây bạch cập
(Hình 1.1)
1.3 Thành phần hoá học
Bạch
cập
Chất
nhầy
Tinh
dầu
Flavonoid
Phytosterol
1.4 Tác dụng và công dụng
• Tính vị: Vị đắng, tính bình.
• Quy kinh: Phế.
• Tác dụng: Bổ phế sinh cơ, hoá ứ, chỉ
huyết, sát trùng giải độc.
• Chủ trị: Thổ ra máu, máu cam, chữa tà khí
vào dạ dày, chứng huyết lỵ, nhiệt sang lâu
khỏi.
• Liều dùng: 4 – 12g dạng bột hay sắc.
Chương 2: Nguyên vật liệu và
phương pháp nghiên cứu
2.1 Nguyên vật liệu
• Nguyên liệu: Vị bạch cập nhập từ Trung Quốc
(Rhizoma Bletillae).
• Dung môi và hoá chất tinh khiết.
• Trang thiết bị và dụng cụ: Tủ sấy, tủ hốt, máy soi
huỳnh quang, máy đo phổ tử ngoại Cintra 40
(Australia)...
• Các chủng vi khuẩn:
–
–
–
–
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Escherichia coli
Bacillus subtilis
2.2 Phương pháp nghiên cứu
• Phương pháp nghiên cứu hoá học:
– Phân tích sơ bộ các nhóm hợp chất có trong dược
liệu theo phương pháp của trường Đại học Dược
khoa Rumani.
– Định tính các nhóm hợp chất bằng các phản ứng
hoá học.
– Định tính các nhóm hợp chất trong dược liệu bằng
sắc kí lớp mỏng.
– Chiết xuất flavonoid trong vị bạch cập bằng cồn
90°.
– Tinh chế flavonoid theo phương pháp sắc kí lớp
chế hoá.
– Sơ bộ nhận dạng flavonoid bằng sắc kí lớp mỏng
và phổ tử ngoại.
– Đánh giá sơ bộ chất nhầy trong vị bạch cập theo
phương pháp trương nở (Dược điển Pháp 1972).
– Định lượng chất nhầy theo phương pháp cân
(Dược điển Việt Nam 2002).
– Thủy phân chất nhầy bằng acid sulfuric 2N đun
nóng.
– Định tính các monosaccharid trong chất nhầy sau
thủy phân bằng sắc kí giấy.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
• Phương pháp nghiên cứu tác dụng kháng
khuẩn:
– Xác định tính kháng khuẩn theo phương pháp
thạch lỗ.
– Xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn theo
phương pháp pha loãng.
2.3 Xử lý số liệu
• Theo phương pháp thống kê y học.
Chương 3: Kết quả và bàn luận
3.1 Kết quả nghiên cứu thành phần hoá
học
3.1.1 Định tính sơ bộ thành phần hoá học vị
bạch cập
Chiết xuất (Hình 3.1)
Bét b¹ch cËp
DÞch chiÕt
ether
ethylic
ChiÕt b»ng ether ethylic trong
dông cô Soxhlet liªn tôc trong 8
giê
Bét dîc liÖu ®·
bay h¬i ether
ethylic
DÞch
chiÕt
ethanol
900
DÞch
chiÕt níc
ChiÕt b»ng ethanol 900 trong
dông cô Soxhlet liªn tôc trong
8 giê
Bét dîc liÖu ®·
bay h¬i ethanol
900
ChiÕt b»ng dung dÞch HCl 1%
B· dîc liÖu
bá ®i
Kết quả định tính (Bảng 3.1)
Tên nhóm chất
Phản ứng định tính
Kết quả
DC ether
Antraquinon
Flavonoid
Với dd KOH 10%
Cyanidin
DC cồn DC nước
Kết luận
sơ bộ


Không có


Có
Vết dầu béo trên giấy

Alcaloid
TT chung của alcaloid

Tinh dầu
Cặn có mùi thơm

Có
Caroten
H2SO4 đậm đặc

Không có
Phytosterol
Lierbermann

Chất béo
Tanin
Với dd FeCl3 + Na acetat
Không có



Acid hữu cơ
Với Na2CO3

Đường khử
Fehling A, B

Anthocyanozid
Protid
Chất nhầy
H2SO4 đậm đặ
NaOH

Không có
Có

Không có
Không có


Có
Không có
Acid nitric đặc

Không có
Chì acetat

Có
3.1.2 Định tính các hợp chất
bằng sắc kí lớp mỏng
Định tính flavonoid:
• Chất thử: Dịch chiết cồn của bột bạch cập, thu
hồi cồn, hoà tan trong nước nóng và lọc. Chiết
bằng ethyl acetat, bốc hơi ethyl acetat, hoà tan
cắn trong một ít cồn 90° được dịch chấm sắc kí.
• Hệ dung môi: Ethyl acetat – acid formic – H2O
(8:1:1).
• Chiều cao chạy là 12,7 cm.
• Thuốc thử hiện màu: dung dịch AlCl3 2% trong
methanol.
3.1.2 Định tính các hợp chất bằng
sắc kí lớp mỏng
Định tính phytosterol:
• Chất thử: Dịch chiết ether bột bạch cập, cô
cạn, hoà tan cắn bằng cồn 90°.
• Hệ dung môi: Cloroform – aceton (8:2).
• Chiều cao chạy là 12,2 cm.
• Thuốc thử hiện màu: dung dịch H2SO4 20%.
3.1.2 Định tính các hợp chất bằng
sắc kí lớp mỏng
Định tính tinh dầu:
• Chất thử: Dịch chiết ether bột bạch cập.
• Hệ dung môi: Ether dầu – ether ethylic
(95:5).
• Chiều cao chạy là 12,8 cm.
• Thuốc thử hiện màu: dung dịch Vanilin –
H2SO4 mới pha.
3.1.3 Tinh chế flavonoid (chất F1)
• Chiết xuất
(Hình 3.5)
Bột bạch cập
Chiết bằng ethanol trong dụng
cụ Soxhlet đun liên tục trong 8
Dịch chiết cồn giờ
Thu hồi cồn
Cặn
Hoà trong 20ml nước nóng
Lọc
Chiết bằng ethyl acetat
Dịch chiết ethyl acetat
Thu hồi ethyl acetat
Cặn
Hoà trong 5ml methanol
Dịch chấm sắc kí
Tinh chế F1 bằng phương pháp sắc kí
lớp chế hoá
• Nhận dạng F1 bằng phản ứng hoá học (Bảng 3.2)
Chất thử
Dịch chiết F1
Phản ứng định tính
Cyanidin
Màu sắc
Đỏ thẫm
Kết quả
++
Dịch chiết F1
Diazoni
Vàng cam
++
Dịch chiết F1
FeCl3
Xanh
++
Dịch chiết F1
NaOH
Vàng cam
++
Dịch chiết F1
H2SO4 đặc
Đỏ cam
++
• Nhận dạng F1 bằng sắc kí lớp mỏng:
Chạy sắc kí lớp mỏng với 3 hệ dung môi:
- Hệ 1: Ethyl acetat – acid formic – H2O (8:1:1).
- Hệ 2: Benzen – pyridin – acid formic (36:9:5).
- Hệ 3: Cloroform – methanol – acid acetic(7:1:1).
• Phổ tử ngoại F1 (Hình 3.7)
3.1.4 Đánh giá sơ bộ chất nhầy trong vị
bạch cập (Bảng 3.3)
Mẫu
Thể tích (V ml)
V - Vtb
(V – Vtb)²
1
11,00
0,40
0,16
2
11,00
0,40
0,16
3
12,00
0,60
0,36
4
11,00
0,40
0,16
5
12,00
0,60
0,36

Vtb
57,00
11,40
1,20
Chỉ số nở: 11,40  0,54 ml
SD = 0,54
3.1.5 Định lượng chất nhầy trong
bạch cập (Bảng 3.4)
Mẫu
M(g)
m(g)
X(%)
1
1,0000
0,5508
55,081
2
1,0020
0,5513
55,020
3
1,0001
0,5498
54,983
4
1,0032
0,5526
55,104
5
1,0040
0,5516
54,952

Xtb
SD = 0,064
275,140
55,028
Hàm lượng chất nhầy: 55,028  0,064 %
3.1.6 Phân tích chất nhầy trong
bạch cập
• Chiết
xuất
(Hình 3.8)
Bột bạch cập
+ H2O
Đun cách thủy
Dịch lọc
+ Cồn
Lọc
Tủa
Bốc hơi cồn
Hoà tan trong H2SO4 2N
Dịch acid
+ Ba(OH)2 đến pH = 7
Dịch thủy phân
chất nhầy
Định tính monosaccharid trong dịch thủy phân
bằng sắc kí giấy:
• Chất hấp phụ: giấy Wathman số 1.
• Chất chuẩn: dung dịch glucose 50%.
• Chất thử: dịch thủy phân chất nhầy.
• Hệ dung môi: n butanol – acid acetic – H2O
(4:1:5, phần trên).
• Chiều cao chạy là 21,7 cm.
• Thuốc thử hiện màu: dung dịch AgNO3 0,1 N /
amoniac 10% (1:1).
3.2 Kết quả nghiên cứu tác dụng kháng
khuẩn
3.2.1 Xác định độ kháng khuẩn
• Dịch chiết nước 3/1 bạch cập
Cấy kiểm tra định tính với 4 chủng vi khuẩn:
- Staphylococcus aureus
- Pseudomonas aeruginosa
- Escherichia coli
- Bacillus subtilis
Đo đường kính vòng vô khuẩn (d)
3.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn
• Tiến hành xác định MIC và MBC đối với 3 chủng:
- Escherichia coli
- Bacillus subtilis
- Pseudomonas aeruginosa
Bacillus subtilis
Sau 2 giờ
Sau 6 giờ
Sau 24 giờ
Vi khuẩn không giảm
Pseudomonas aeruginosa
Sau 2 giờ
Sau 6 giờ
Sau 24 giờ
Vi khuẩn không giảm
Nhận xét
• Với Escherichia coli:
MIC = 1/16
MBC = 1/8
• Với Bacillus subtilis:
Không thấy MIC, MBC
• Với Pseudomonas aeruginosa:
Không thấy MIC, MBC
Kết luận
1.Thành phần hoá học vị bạch cập:
• Bằng các phản ứng hoá học đã sơ bộ xác định được
trong vị bạch cập nghiên cứu có chất nhầy, tinh dầu,
flavonoid, phytosterol và đường khử.
• Định tính bằng sắc kí lớp mỏng:
- Nhóm flavonoid tách được 1 vết có Rf x 100 = 74.
- Nhóm tinh dầu tách được 3 vết có Rf x 100 = 11, 18, 27.
- Nhóm phytosterol tách được 5 vết có Rf x 100 = 24, 40,
58, 84, 93.
• Phổ tử ngoại của chất F1 cho 2 pick là 211,8 nm và
277,5 nm mang đặc trưng của nhóm flavonoid thuộc
phân nhóm flavan
• Về chất nhầy trong bạch cập:
- Chỉ số nở:
11,40  0,54 ml.
- Hàm lượng: 55,028  0,064 %.
• Phân tích monosaccharid của chất nhầy trong bạch
cập bằng sắc kí giấy cho 2 vết:
- 1 vết có Rf1 x 100 = 16 tương đương với glucose.
- 1 vết có Rf2 x 100 = 22.
2. Tác dụng kháng khuẩn của vị bạch cập:
• Dịch chiết nước 3/1 của bạch cập có:
- Tác dụng mạnh đối với Escherichia coli
với MIC = 1/16, MBC = 1/8.
- Tác dụng trung bình đối với Bacillus subtilis.
- Tác dụng yếu đối với Pseudomonas aeruginosa.
- Không có tác dụng đối với Staphylococcus aureus.
Kiến nghị
• Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn nữa về thành phần
hoá học của vị bạch cập.
• Nghiên cứu thêm về tác dụng kháng khuẩn nói
riêng và các tác dụng sinh học nói chung cũng
như những ứng dụng thực tế trong điều trị
bệnh của vị thuốc bạch cập.