Transcript KULTURA BILJNIH ĆELIJA I TKIVA IN VITRO
KULTURA BILJNIH ĆELIJA I TKIVA
IN VITRO
In vitro
kultura?
•
In vitro kultura biljnih sastava sredine.
i pod ćelija, tkiva i organa je posebna grana biotehnologije biljaka koja predstavlja skup tehnika za aseptično (sterilno) gajenje i vegetativno razmnožavanje biljaka, biljnih organa, tkiva i ćelija, u hranljivom medijumu definisanog kontrolisanim uslovima
• Biljne ćelije i tkiva imaju sposobnost da rastu i da se razvijaju kada se izoluju iz organizma i gaje na sintetičkoj podlozi.
•
Totipotencija -
biljnih Sposobnost ćelija da se
in vitro
dediferenciraju, dele embrione ili celu biljku i da regenerišu pojedine organe, •
Plasti
rasta,
čnost
– sposobnost biljke da menja svoj program razvića i metabolizma, u zavisnosti signala iz od uslova spoljašnje sredine.
i
• Postoje različiti tipovi biljnih kultura
in vitro.
•
Prema tipu eksplantata –
za pokretanje kulture
in vitro
tj.
se mogu koristiti gotovo svi delovi biljke različiti
eksplantati
, počev od embriona, preko delova klijanaca - korena, kotiledona, epikotila i hipokotila (kod dikotila), odnosno mezokotila i koleoptila (kod monokotila) i svih delova odrasle biljke, uključujući listove, lisne peteljke i delove cveta
.
•
Prema nameni
, kulture se klasifikuju kao kulture haploida, kulture korenova, kulture za mikropropagaciju,
in vitro
propagacija, somatska embriogeneza, somaklonalno variranje,...
•
Prema toma kakav je rast
: organizovan, neorganizovan i mešovit rast
Vegetativno razmnožavanje biljaka u kulturi
in vitro
Gde se vrši vegetativno razmnožavanje biljaka
in vitro
Laminarna komora kontaminacija
Mikropropagacija u užem i širem smislu
Sl. Mikropropagacija u
u kulturu;
3 а užem i širem smislu 1а
rast izdanaka;
4 а
sakupljanje – multiplikacija izdanaka;
6
bočnih I vršnih pupoljaka; – ožiljavanje izdanaka;
7 2 а
– uvođenje pupoljaka – adaptacija u staklari. Desno su osnovni koraci razmnožavanja stabla kao primarnih eksplantata;
in vitro
2 б
putem regeneracije izdanka iz kalusa: – uvođenje eksplantata u kulturu;
3 б 1 б
izolovanje delova listova i – indukcija kalusa na eksplantatima;
4 б
– kultura nediferenciranih kalusa;
5 б
indukcija izdanaka u kalusu;
6
– ožiljavanje izdanaka;
7
– adaptacija u staklari.
Organogeneza iz kalusa
Organogeneza iz kalusa
Izdanak u kulturi
Direktna organogeneza
Umnožavanje izdanaka
Prednosti vegetativnog razmnožavanja u uslovima
in vitro
• 1.
In vitro
razmnožavanje mnogo je brže od
in vivo
razmnožavanja • 2. Moguće je umnožiti i one biljke koje nije moguće umnožiti u
in vivo
uslovima • 3. Mikroklonirane biljke često rastu bolje i brže od biljaka koje rastu u in vivo uslovima (oslobođene su od patogena i infekcija bakterijama i gljivama) • 4. U
in vitro
kulturi se razmnožavaju samo zdrave biljke • 5. Vegetativno razmnožavanje u
in vitro
uslovima može početi sa vrlo malo biljnog materijala kao početnog eksplantata • 6. Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je predvideti vremenski proizvodnju određenih kultura • 7. Veliki značaj ovaj vid razmnožavanja našao je u
ex situ
ugroženih i retkih biljnih vrsta (npr.
Nepeta rtanjensis
) zaštiti
Nedostaci vegetativnog razmnožavanja u uslovima
in vitro
• • 1. U nekim kulturama koje se razmnožavaju na ovaj način genetička stabilnost je niska • 2. Kod drvenastih vrsta teško je uspostaviti formiranje korenovog sistema
in vitro 3.
Prenos biljaka iz uslova
in vitro
u uslove nekada je jako težak i mukotrpan posao
in vivo
• 4. Regenerativna sposobnost se može izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva • 5. U nekim slučajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu
in vitro
je izuzetno teška
Komercijalizacija mikropropagacije 1970s & 1980-tih Murashige 197
4
Broad commercial application
•
Šta je organogeneza?
Organogeneza
obrazovanja jedinki.
u najosnovnijem obliku značenja predstavlja proces • U
in vitro
uslovima kontrolisanje se organogeneze vrši dodavanje određenih komponenti, a najbitnije među komponentama jesu
FITOHORMONI.
Skoog i Miller hipoteza
• Prekretnica, 1957. balans citokinina i auksina reguliše organogenezu kalusa Skoog i Miller • Ova hipoteza koncentracija govori auksina i o odnosu citokinina u hranljivom medijumu i kako zapravo date koncentracije utiču na morfogenezu u uslovima
in vitro
•
Dokazi Milerove hipoteze
• Dejstvo citokinina i auksina na organogenezu može se pokazati sledećim primerom. Ako se izoluje deo tkiva stabla duvana i gaji na hranljivoj podlozi koja nutritivne sastojke, a od hormona se dodaju auksin (indol sadrži koncentracijama, potrebne sirćetna kiselina) i citokinin (kinetin) u istim doći će do deobe ćelija i njihovog uvećavanja. Na ovakvom medijumu stvara se koji se sastoji od mase nediferenciranih
kalus
ćelija.
Ako se kalusno tkivo prenese na hranljivu podlogu koja koncentraciju auksina nego citokinina, koncentracija citokinina pojaviće se sadrži veću
korenovi
. Ako je veća od koncentracije auksina, pojaviće se
pupoljci.
Kod Gloxinie
BA 0.3 (mg/L) NAA 0 0.3 0.1 0.3
0.3 0.3 1.0 0.3
3.0
Kultura kalusa
•
Kultura tkiva
odnosno
kultura kalusa
je tehnika kojom se tkivo može održavati u nediferenciranom stanju neograničeno dugo.
• Kultura kalusa se može dobiti iz bilo kog vegetativnog tkiva dediferencijacijom, tako da kalusna tkiva najčešće nisu fotosintetička.
• Kalusi se često gaje u mraku jer svetlost može podstaći diferencijaciju.
• Kalusi se, generalno, mogu podeliti na dva tipa:
kompaktne
i
rastresite
.
SOMATSKA EMBRIOGENEZA
•
Somatska embriogeneza
je proces u kome haploidne ili diploidne somatske kroz ćelije prolaze karakteristične embrionalne stadijume bez fuzije gameta i mogu stvarati kompletne biljke • Prvi somatski embrioni dobijeni su u kulturi ćelija šargarepe
•
1. Direktna (neposredna) embriogeneza -
neposredno iz embrioni se stvaraju pojedinačnih ćelija, što može smanjiti stepen varijabilnosti u kulturi. Na razvoj ovih embriona utiče sastav hranljive podloge i izbor eksplantata.
Direktna somatska embriogeneza
•
2. Indirektna (posredna) embriogeneza -
ovom metodom se prvo stvara kalusno tkivo u kome se kasnije zameću embrioni Indirektna somatska embriogeneza
“Prirodna” somatska embriogeneza, kao alternativna strategija reprodukcije biljaka
Kultura protoplasta
Šta je protoplast
• •
Protoplasti
su gole biljne zida, tako da su ćelije, bez ćelijskog zaštićene jedino plazmalemom.
• Protoplasti mogu iznova da regenerišu ćelijski zid, da rastu i da se dele
Kultura protoplasta
, „ogoljenih“ ćelija bez ćelijskog zida, se može dobiti bilo iz ćelijske suspenzije, bilo direktno iz mezofila lista.
zid se Ćelijski obično uklanja enzimskim tretmanom, dejstvom celulaza i pektinaza u rastvoru visokog osmolariteta.
• Uklanjanje
protoplasta
ćelijskog i
somatskih hibrida.
zida dobijanje omogućava intra ili i
fuziju
interspecijskih • Protoplasti su idealan materijal za transformaciju pomoću različitih tehnika, kao što su elektroporacija, mikroinjektiranje ili hemijska transformacija • Prebacivanjem protoplasta na čvrst medijum se dobijaju kalusi, iz kojih se mogu regenerisati cele biljke bilo organogenezom, bilo somatskom embriogenezom.
Principi gajenja biljaka u kulturi in vitro
• Gajenje
in vitro
relevantnih kultura podrazumeva kontrolu svih činilaca (faktora), počev od izbora eksplantata i uspostavljanja aseptičnih (sterilnih) uslova, preko manipulacie razvića u kulturi putem definisanja sastava medijuma, prvenstveno balansa hormona, do kontrole spoljašnjih faktora sredine kao što su svetlost, vlažnost i temperatura.
• Kultura in vitro se uvek uspostavlja u aseptičnim uslovima, kako ne bi došlo do razvoja gljiva i bakterija, koje sprečavaju rastenje i razviće biljaka.
• Rad sa
in vitro
kao što su: kulturom podrazumeva i neke od vidiva sterilizacije •
1.
Sterilizacija autoklaviranjem petri kutije,...) (na ovaj način se sterilišu medijumi za gajenje biljaka, kao i posude u kojima se biljke gaje npr. teglice, erlenmajeri, boce, tegle, epruvete,
•
2.
Sterilizacija iskuvavanjem sterilišu instrumenti za rad ( na ovaj koji manipulativnim tehnikama u laminaru) su način najčešće se neophodni pri
•
3.
Sterilizacija biljnog materijala ( koja je kao dezinfestacija). Za ovu sterilizaciju se razblažena NaClO (varikina ili domestos).
još označena i najčešće koristi
•
4.
Sterilizacija filtriranjem filter papira , gde se pomoću specijalnih vrši sterilizacija nestabilnih jedinjenja kao što je npr. ABA, GA 3, antibiotici ili neki vitamini. Ove komponente se naknadno dodaju u prohlađeni medijum.
Autoklav
•
Medijumi
za gajenje
polučvrsti ili tečni
.
biljaka mogu biti
čvrsti,
• Za većinu kultura optimalan pH podloge je 5.8 ± 0.2.
Tečni medijum za razliku od čvrstog ne sadrži agar.
Vrlo bitna komponenta svakog medijuma jesu i makro i mikro soli, kao i vitamini.
Medijum koji je razliven u erlenmajere
Prostor za gajenje biljaka
Posebne prostorije sa optimalnim uslovima za gajenje biljaka