Transcript xray latviski biologiem

Ievads proteīnu kristalogrāfijā
(proteīnu rentgenstruktūranalīzē)
Kristalogrāfija vai rentgenstruktūranalīze - metode vielas
molekulu trīsdimensionālās struktūras noteikšanai,
izmantojot rentgenstaru difrakciju vielas kristālos
1
2014. – starptautiskais
kristalogrāfijas gads
2
Kristalogrāfijas vēsture: ideja
• 1912. gadā Maksim fon Lauē un Pēterim Paulam Ēvaldam vēsturiskā
sarunā Angļu dārzā Minhenē radās ideja apstarot kristālus ar
rentgenstariem
• 1913. gadā tika iegūts pirmais difrakcijas attēls no vara sulfāta
kristāla, par ko Lauē 1914. gadā saņēma Nobela prēmiju
3
Kristalogrāfijas vēsture: pirmā struktūra
• 1913. gadā Viljams Lorenss Bregs no difrakcijas datiem
izskaitļoja NaCl struktūru, par to 1915. gadā saņēma Nobela
prēmiju kopā ar savu tēvu Viljamu Henriju Bregu
4
Kristalogrāfijas vēsture: pirmā
proteīna struktūra
• 1958. gadā tika noteikta pirmo proteīnu –
mioglobīna un hemoglobīna struktūras, par ko
1962. gadā Nobela prēmiju saņēma Makss Perutzs
un Džons Kendrjū
5
Kāpēc nepieciešams noteikt
proteīnu struktūras?
• Vizuāls attēls – kā
proteīns izskatās
• Priekšstats par to, kā
proteīns veic savas
funkcijas
• Nobela prēmijas...
6
Nobela prēmijas proteīnu
kristalogrāfijā
• M. F. Perutz, Sir J. C. Kendrew (Chemistry, 1962) for structure of
globines
• Sir A. Klug (Chemistry, 1982) for his development of crystallographic
electron microscopy and his structural elucidation of biologically important
nuclei acid-protein complexes
• J. Deisenhofer, R. Huber, H. Michel (Chemistry, 1988) for the
determination of the three-dimensional structure of a photosynthetic
reaction centre
• P. D. Boyer, J. E. Walker, J. C. Skou (Chemistry, 1997) for their
elucidation of the enzymatic mechanism underlying the synthesis of
adenosine triphosphate (ATP) and for the first discovery of an iontransporting enzyme, Na+, K+ -ATPase
• R. D. Kornberg (Chemistry, 2006) for his studies of the molecular basis of
eukaryotic transcription
• V. Ramakrishnan, T. A. Steitz, Ada E. Yonath (Chemistry, 2009) for
studies of the structure and function of the ribosome
• Robert J. Lefkowitz and Brian K. Kobilka (Chemistry, 2012) for studies
7
of G-protein-coupled receptors"
Pielietojuma piemērs: jaunu zāļu radīšana
• Ar kristalogrāfijas palīdzību var noteikt proteīnu struktūras
• Zinot proteīna aktīvā centra struktūru, var prognozēt, kādi
savienojumi tur varētu piesaistīties
• Labs piemērs – Indinavir (Merck), viens no pirmajiem preparātiem,
kuru radīšanā tika pielietota proteīnu kristalogrāfija
HIV proteāze
Aktīv
ais
centrs
8
Kādas manipulācijas jāveic, lai
noteiktu proteīnu struktūru
•
•
•
•
•
•
•
1. – proteīna gēna klonēšana (parasti baktērijās)
2. – proteīna producēšana
3. – proteīna attīrīšana
4. – proteīna kristalizēšana
5. – datu vākšana no kristāliem
6. – struktūras noteikšana
7. – struktūras validēšana un deponēšana PDB
datu bankā
• 8. – struktūras publicēšana
9
10
Kas ir kristāls ?
• Trīsdimensionāls identisku vienības šūnu
režģis, kuras ir izvietotas vienā noteiktā
orientācijā
• Katra vienības šūna var saturēt vienu vai
vairākas molekulas
11
Kristāls
Kristāls
Molekula
Vienības šūna
Šajā gadījumā katrā vienības šūnā ir viena
molekula un visas vienības šūnas ir taisnstūru
paralēlskaldņi
12
Molekula
Vienības šūna
Kristāls
Divas molekulas vienības šūnā, kuras malu leņķi nav
90o
13
Kā iegūt kristālu?
• Vienkārši no neorganiskajām un mazām
organiskajām molekulām
• Grūti no proteīniem
• Kāpēc?
-nav termostabili
-var izmantot tikai uz ūdeni bāzētus šķīdumus
-lielas un fleksiblas molekulas
-parasti pieejami ļoti nelielos daudzumos
14
Kā iegūt proteīnu kristālu ?
• Princips: lēni paaugstināt precipitantu koncentrāciju šķīdumā
• Precipitanti: dažādi sāļi, polietilēnglikoli (PEG), alkoholi
• pH buferējošās vielas uztur noteiktu pH – piemēram, acetāta vai tris
buferšķīdumi
• Aditīvi: vielas, kas nav precipitanti, bet mijiedarbojas ar proteīnu un
palīdz tos sakristalizēt (piemēram metālu joni)
• Variējamie parametri:
-precipitantu un aditīvu sastāvs
-precipitantu un aditīvu koncentrācija
-proteīna koncentrācija (parasti ap 1%)
-pH
-temperatūra (parasti RT, dažreiz +4, +15 vai +37)
Parasti nav iespējams teorētiski noteikt, kādi precipitanti un kādās
koncentrācijās varētu būt nepieciešami, lai veidotos kristāli
15
Parasti nepieciešams testēt vairākus simtus dažādu apstākļu
Fāzes diagramma
[proteīns]
nogulsnes
kristāli?
tīrs šķīdums
[precipitants] 16
Sēdošā piliena iztvaikošanas tehnika
Iztvaikošana
Precipitants +
proteīns (1:1)
Precipitants
Iztvaikošanas rezultātā lēnām samazinās piliena tilpums un
paaugstinās precipitanta un proteīna koncentrācija
17
Kristalizācijas robots
• Var viegli pārbaudīt
simtiem apstākļu
• Var operēt ar ļoti maziem
tilpumiem –līdz 0.1 ml
18
Piekārtā piliena iztvaikošanas tehnika
Iztvaikošana
Precipitants +
proteīns (1:1)
Precipitants
Princips līdzīgs, kā sēdošajam pilienam, tikai piliens ir
«piekārts» pie trauciņa vāka
19
Olu baltuma lizocīma kristalizēšana ar
piekārtā piliena tehnoloģiju
• Lizocīms ir ļoti viegli kristalizējams proteīns
• Kristālus var iegūt dažu minūšu laikā
• Mēs izmantosim piekārtā piliena tehnoloģijas atvieglotu
variantu – bez precipitanta trauciņa apakšā
• Lizocīmu sajauksim ar precipitantu un pilienam ļausim
lekcijas turpinājumā lēnām iztvaikot
• Pēc lekcijas beigām aplūkosim kristālus mikroskopā un
pārbaudīsim to difrakcijas kvalitāti
20
Mini lab. darba protokols
• Uz stikla plāksnītes sajaucam pilienu no 5 ml lizocīma
šķiduma (40 mg/ml) un 5ml precipitanta (30% w/v
metilpolietilēnglikols 5,000, 1.0 M NaCl, 50 mM Na acetāts
pH 4.5, 5% glicerīns)
• Plāksnīti nosedz ar Petri plates vāciņu
• Pēc lekcijas beigām pilienus aplūko mikroskopā
• Vienu no iegūtajiem kristāliem ar cilpas palīdzību izņem no
šķīduma un ievieto krioplūsmā rentgenstaru difrakcijas
aparātā
• Darba vadītājs demonstrē difrakcijas attēlu iegūšanu no
kristāla
21
Kāpēc nepieciešami tieši
rentgensari?
• Viļņa garumam ir aptuveni tāds pats izmērs,
kā attālums starp atomiem molekulās
22
Kā iegūt rentgenstarus?
Sinhrotrons
Rotējošais anods
Daļiņu paātrinātājs
Elektronu kūlis no katoda
atsitas pret metāla (parasti
Cu) anodu un producē
rentgenstarus
Lielā ātrumā mainot
kustības virzienu,
elementārdaļiņas
(elektroni vai pozitroni)
emitē rentgenstarus
X-rays
Copper anode
23
Rotējošais anods Sinhrotrons
• Labi:
-Relatīvi lēti (1/2 milj. $)
-Relatīvi mazi
• Slikti:
-Radiācija ir vāja
-Viļņa garums ir fiksēts
• Labi:
-Radiācija ir spēcīga
-Viļņa garums ir
maināms
• Slikti:
-Ļoti dārgi (miljardi $)
-Ļoti lieli
24
ESRF sinhrotrons Grenoblē, Francijā
• Visspēcīgākais rentgenstaru avots Eiropā
• Akadēmiskiem pētījumiem bezmaksas
25
Elektromagnētiskie viļņi
E
E
l
l
Z
z
z
A
A
E = A cos wt
E = A cos (a+wt)
w = 2pn
a = 2pZ/l
• E- elektromagnētiskā lauka stiprums
• A- amplitūda
• w- leņķiskais ātrums
• n- frekvence
• l – viļņa garums
•
a - fāze
26
Imaginārā ass
Vilnis kā vektors
A
A- viļņa amplitūda
a- viļņa fāze
a
Reālā ass
F=Acosa+iAsina vai
F=exp(ia)
27
Viļņu interference
+
+
=
=
.
28
Kas notiek ar elektronu, kad pa
to trāpa rentgenstari?
• Elektrons sāk vibrēt ar tādu pašu frekvenci, ka
krītošie rentgenstari
• Rezultātā, elektrons izstaro sekundāros
rentgenstarus visos virzienos
Primārais stars
Sekundārie
stari
29
Izkliede no molekulas
• Molekula sastāv no vairākiem atomiem
• Atomu sastāvā ir elektroni
• Ja molekulu apstaro ar rentgenstariem, katrs elektrons izstaro (izkliedē)
sekundāros rentgenstarus
• Izstarotie rentgenstari mijiedarbojas viens ar otru un veido interferenci
• Kopējā rentgenstaru izkliede no molekulas ir atkarīga no elektronu
skaita un to savstarpējā novietojuma
• Citiem vārdiem sakot, izkliede ir atkarīga no molekulas struktūras
• Ja mēs zinātu izkliedēto staru amplitūdas un fāzes, vai varētu aprēķināt
molekulas struktūru?
Primārais stars
30
Furjē transformācija
• F(k)=
f(x)e-2pikx dx
• Elektronu blīvuma sadalījums molekulā un
molekulas veidotais rentgenstaru izkliedes attēls ir
savstarpējas Furjē transformācijas
• Tātad – ja varētu izmērīt vienas molekulas
izkliedēto rentgenstaru amplitūdas un fāzes,
struktūras aprēķins būtu trivāls
• Bet ir divas problēmas...
31
Praksē...
• Izkliede no vienas molekulas ir pārāk vāja, lai to
varētu detektēt
• Izkliede no daudzām molekulām atšķirīgās
orientācijās (piem. šķīdumā) novedīs pie
izkliedēto staru savstarpējas dzēšanās
• Ja molekulas ir orientētas visas vienā virzienā (kā
kristālā), rentgenstaru izkliede pastiprināsies
noteiktos virzienos
32
Brega likums
Izkliedētie stari ir vienā
fāzē, tie summējas
Izkliedētie stari ir
pretējās fāzēs, tie
savstarpēji dzēšas
nl = 2d sinq
Brega likums nosaka, ka izkliedētie stari
summējas, ja to ceļu garumi atšķiras par n
33
veseliem viļņa garumiem
Tipisks difrakcijas attēls no
proteīna kristāla
Uz viena attēla ir tikai
neliela daļa no visiem
teorētiski iespējamajiem
difrakcijas punktiem
Kristālu pagriež pa 0.2-2
grādiem un iegūst nākošo
attēlu un tā tālāk
Atkarībā no vienības šūnas
izmēra un izšķirtspējas ir
jāsavāc 100 -1000 attēlu ar
104-106 difrakcijas 34
punktiem
Izšķirtspēja
• Mazākais attālums, ko
var izšķirt elektronu
blīvuma kartē
• Atbilst mazākajam
attālumam starp
atstarojošām plaknēm,
kurām var saskatīt
difrakcijas punktus
• Augstas izšķirtspējas
difrakcijas punkti ir tālāk
no attēla centra
• Izšķirtspēja ir atkarīga no
tā, cik perfekti ir
izkārtotas vienības šūnas
2Å
3Å
5Å
10Å
35
Augstas izšķirtspējas
kristāls
Zemas izšķirtspējas
kristāls
• No kā atkarīga kristāla kvalitāte?
-No molekulu kontaktiem kristālā – no to
skaita (vairāk=labāk) un rakstura
-No molekulu fleksibilitātes (jo fleksiblāka, jo
sliktāk)
36
Vai kristālu ārējam izskatam ir
korelācija ar izšķirtspēju?
Kamolzāles raibuma
vīrusa kristāli,
izšķirtspēja 3.7Å
Tā paša vīrusa kristāli (audzēti
citos apstākļos). Izšķirtspēja
2.6Å
• Īpašas korelācijas nav
• Vienīgais veids kā pārbaudīt kristālu
kvalitāti ir ievietot tos rentgenstaros
37
Fāzes problēma
• Ar detektoru var izmērīt tikai difrakcijas punktu
intensitāti
• Informācija par fāzēm netiek fiksēta – nav tādas ierīces,
kā “fāzesmetrs”
• Tas nozīmē, ka informācija par fāzēm ir jāiegūst netieši
• Mazām molekulām (<100 atomu) eksistē tiešās metodes.
Tas nozīmē, ka fāzes var izskaitļot no amplitūdām bez
jebkādas papildus informācijas.
• Proteīni ir daudzkārt par lielu lai izmantotu tiešās
metodes, tāpēc ir izstrādātas citas metodes
38
Mazās molekulas (<100 atomu)
Difrakcija
NaCl NaCl
NaCl NaCl
Struktūras aprēķins tikai
no punktu intensitātēm
Proteīni (>>100 atomu)
Difrakcija
Struktūras aprēķins tikai
no punktu intensitātēm
39
Izomorfā aizvietošana
• Ieviešot proteīnu kristālos smagos atomus,
difrakcijas punktu intensitāte izmainās
• No izmaiņām var noteikt smago atomu
atrašanās vietas un no tām - fāzes
• Jāizmanto vismaz divi dažādi smagie
elementi
40
Pb2+
A
A-B
B
Smago metālu
struktūras aprēķins kā
mazajām molekulām
Fāzes aprēķins
41
Izomorfās aizvietošnas problēmas:
• 1) Vienības šūnas izmēri var izmainīties. Tas
izmainīs difrakcijas režģi un metodi vairs nevar
izmantot
• 2) Proteīna struktūra vai tā orientācija vienības
šūnā var izmainīties
• 3) Kristālu var sabojāt, to mērcējot smago
elementu šķīdumā
• 4) Smagie atomi var nepiesaistīties noteiktās
vietās
• -Problēmas daļēji iespējams risināt, proteīna
sastāvā ieviešot selenometionīnu (Selēns ir smags
42
elements)
Molekulārā aizvietošana
• Šobrīd visizplatītākā metode
• Var pielietot tikai tad, ja ir zināma līdzīga proteīna struktūra
(vismaz 25% sekvences identitāte)
• Zināmās struktūras fāzes tiek kombinētas ar nezināmās
struktūras amplitūdām
• Kombinēšana ir iespējama tikai tad, ja abu struktūru kristālu
vienības šūnu parametri ir identiski un molekulas tajā ir
identiskās orientācijās
43
Novērotās amplitūdas
Furjē kaķis
Fāzes nav
zināmas!
FFT
Zināma struktūra
Bezastes kaķis
Nezināmā struktūra
Kaķis
Izskaitļotās amplitūdas
un fāzes
FFT
Furjē bezastes kaķis
44
Novērotās amplitūdas,
izskaitļotās fāzes
FFT
Aste ir redzama!
45
Ja struktūras nav pietiekoši līdzīgas...
Pīle
Furjē pīle
Pīles amplitūdas +
kaķa fāzes
Kaķis !!!???
46
Kā praksē kombinēt fāzes un
amplitūdas
• Fāzes un amplitūdas ir iespējams kombinēt tikai
no kristāliem ar identiskiem vienības šūnu
izmēriem
• Ja kristālu simetrija vai vienības šūnas izmēri
atšķiras, iegūst dažādus difrakcijas režģus
• Praksē zināmās un nezināmās struktūras proteīnu
kristāliem reti kad ir vienādi vienības šūnu
parametri
• Tādēļ nepieciešams zināmo struktūru ievietot
teorētiskā kristālā, lai sakristu vienības šūnu
parametri un molekulu orientācija
• Kā noteikt molekulu orientāciju nezināmajā
struktūrā???
47
Teorētiskā difrakcijas režģa aprēķins
zināmai molekulai virtuālā kristālā
Furjē
transformācija
Furjē
transformācija
48
Rotācijas un translācijas funkcijas
rotācija
translācija
• Uzdevumu matemātiski iespējams sadalīt divās daļās – rotācijas
meklējumā un translācijas meklējumā (funkcijās)
• Zināmo molekulu daudzās dažādās orientācijās ievieto virtuālajā
kristālā, kura vienības šūnu izmērs ir tāds pats kā nezināmās struktūras
eksperimentāli iegūtajam kristālam
• Katrai orientācijai izskaitļo Furjē transformāciju un iegūst teorētiskās
intensitātes
• Pareizajā orientācijā ir visaugstākā eksperimentālo un teorētisko49
intensitāšu korelācija
Zināma struktūra A
Nezināma struktūra B
A un B orientācijas
ir atšķirīgas
Furjē transformācija
Difrakcijas
punktu
intensitātes ir
ļoti atšķirīgas
50
Zināma struktūra A
Nezināma struktūra B
A un B orientācijas
ir līdzīgas
Furjē transformācija
Difrakcijas
punktu
intensitātes ir
līdzīgas
51
Modeļa veidošana
• Proteīnu sekvences savietošana ar novēroto
elektronu blīvumu
• Vienkārša molekulārajā aizvietošanā
• Sarežģītāka, ja nav līdzīgas zināmas struktūras
• Viennozīmīga pie pietiekoši augstas izšķirtspējas
(labākas par 3.0 Å)
• Var tikt automatizēta, ja izšķirtspēja ir 2.5Å vai
labāka
52
53
54
2.0 Å
55
Rifainments (Refinement)
• Automatizēta modeļa uzlabošana, lai labāk
izskaidrotu eksperimentālās amplitūdas
• Arī fāzes tiek uzlabotas, tādejādi uzlabojas
elektronu blīvuma kartes kvalitāte
56
Validēšana
• Finālā (?) modeļa kvalitātes pārbaude
• Kā izskatās aminoskābju ģeometrija?
(Ramačandrāna plots, u.c.)
• Vai nekovalenti saistītie atomi ir pietiekoši tālu
viens no otra?
• Vai aminoskābes iederas apkārtējā vidē?
(Hidrofobās proteīna iekšienē, polārās uz virsmas)
• Vai ūdeņraža saišu donori/akceptori ir
kompensēti?
57
Deponēšana
• Struktūras deponēšana PDB datu bankā ir
priekšnosacījums publicēšanai žurnālos
• Vajadzētu deponēt arī eksperimentālos datus, lai būtu
iespējams ģenerēt elektronu blīvuma karti un
pārleicināties, ka modelis tai atbilst
58
Neuzmanības rezultātā...
59
• Zinātnieks no Scripps institūta publicēja divas
pilnīgi nepareizas struktūras
• Struktūras izraisīja milzīgu interesi, jo bija ļoti
atšķirīgas no gaidītā
• 3 raksti Science, viens JMB un viens PNAS
• Pēc kļūdas noskaidrošanas, visi raksti tika
atsaukti
• Viss finansējums un prezidenta dotās medaļas
atņemtas...
• Veicot vienkāršu validēšanu, no tā visa varētu
izvairīties
60