Transcript Powi*zania *cie*ek sygna*owych NFkB i p53

Funkcjonalne współzależności szlaków sygnałowych
zależnych od czynników transkrypcyjnych
TP53 i NFkB.
Katarzyna Szołtysek
Mechanizm regulacji NFkB, współzależności z TP53
TP53 jako czynnik transkrypcyjny
www.brc.riken.jp/.../201p53_network.html
Regulacja aktywacji TP53
 MDM2 negatywny regulator p53:
• wiąże się z domeną TA p53
• eksport p53 z jądra komórkowego
• funkcja ligazy ubikwityny
 PTEN pozytywny regulator p53:
• defosforyluje PIP3 (Pi3-4-5P)
• blokada aktywacji Akt/PKB
http://p53.free.fr/index.html
Cel pracy

zidentyfikowanie i scharakteryzowanie funkcjonalnych współzależności
pomiędzy szlakami sygnałowymi zależnymi od czynników transkrypcyjnych
NFkB i TP53

analiza wpływu aktywacji szlaku zależnego od NFkB na przeżycie komórek
nowotworowych eksponowanych na czynniki genotoksyczne (promieniowanie UV
i promieniowanie jonizujące)

analiza profilu ekspresji wybranych genów regulowanych przez czynniki
transkrypcyjne NFkB i TP53, w warunkach kontrolnych i w komórkach
eksponowanych na czynniki stresu komórkowego

identyfikacja genów, na których aktywność mają wpływ oba czynniki transkrypcyjne
i opracowanie modelu funkcjonalnych współzależności obu szlaków sygnałowych
Model doświadczalny
HCT116 (rak jelita grubego)


p53+/+ (wt)
p53-/- (bi-allelic knock-out)
HCT116
STATUS p53:
A – RT-PCR
B – Western blot
A
B
Analiza poziomu ekspresji genów oraz białek TP53 zależnych
Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)
Analiza (WB, qRT-PCR):
regulacja p53
blokada cyklu komórkowego
indukcja apoptozy
Analiza poziomu ekspresji genów oraz białek TP53 zależnych
Analiza aktywacji badanych ścieżek sygnałowych
Indukcja białka p53:
A
A – Western blot
Indukcja ścieżki NFkB:
B – Western blot
C – RT-PCR
B
C
Analiza poziomu ekspresji genów TP53 zależnych
Schemat ścieżki sygnałowej TP53
Analiza ekspresji genów regulatorowych, zależnych od TP53 – MDM2
HCT116
HCT116 p53-/-
Analiza ekspresji genów regulatorowych, zależnych od TP53 – PTEN
HCT116
HCT116 p53-/-
Analiza ekspresji genów zależnych od TP53 – p21
HCT116
HCT116 p53-/-
Analiza ekspresji genów zależnych od TP53 – Noxa
HCT116
HCT116 p53-/-
Wnioski:

stymulacja komórek TNFa wpływa na aktywację genów zależnych od p53,
wywołaną promieniowaniem UV

poziom ekspresji MDM2 i PTEN ulega podwyższeniu w obu stosowanych
schematach

poziom ekspresji p21/WAF1 i Noxa ulega początkowemu obniżeniu, a
następnie podwyższeniu w obu stosowanych schematach aktywacji
analizowanych ścieżek sygnałowych
Analiza poziomu ekspresji genów NFkB zależnych
Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)
Analiza: qRT-PCR
PCR Array (SABioscience NFkB dependent genes)
Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB
Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)
Analiza: cDNA 1h
Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB
Linia komórkowa: HCT116 (wt, p53-/-)
Analiza: cDNA 1h
Analiza ekspresji genów zależnych od NFkB
Analiza qRT-PCR: BCL3, NFKBIA, REL,
IL1A, IL8,
TNF, TNFAIP3