Transcript analiza QRT-PCR

POWIĄZANIA SZLAKÓW SYGNAŁOWYCH
ZALEŻNYCH OD CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH
NFkB I p53 W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH
PODDANYCH DZIAŁANIU CZYNNIKÓW
GENOTOKSYCZNYCH –
wpływ promieniowania na przebieg szlaku NFkB
Katarzyna Szołtysek
Centrum Badań Translacyjnych i Biologii
Molekularnej Nowotworów
Mechanizm regulacji NFkB, współzależności z p53
Cel pracy
Identyfikacja funkcjonalnych współzależności między szlakami sygnałowymi
zależnymi od czynników transkrypcyjnych NFkB i p53, poprzez m.in.
scharakteryzowanie wpływu każdego z tych białek na ekspresję genów
regulowanych przez drugi czynnik
Cel szczegółowy: wpływ promieniowania na przebieg ścieżki NFkB

Analiza kinetyki aktywacji i przebiegu ścieżki sygnałowej zależnej od NFkB
w komórkach stymulowanych promieniowaniem i /lub cytokiną TNFa (analiza Westernblot i EMSA)

Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na ekspresję
wybranych genów regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NFkB (analiza QRTPCR)

Analiza wpływu czasu
napromieniowania na ekspresję wybranych genów
regulowanych przez czynnik transkrypcyjny NFkB (analiza QRT-PCR)
Model doświadczalny
HCT116 (human colon carcinoma)
 p53+/+ (wt)
 p53-/- (knock-out)
RYC.1. Komórki linii HCT116 (wt).
Charakterystyka modelu doświadczalnego:
 Indukcja/akumulacja białka p53
 Indukcja ścieżki NFkB - degradacja inhibitora IkBa
RYC.2. Transkrypcja genu TP53 (RT-PCR) w komórkach linii HCT116 pod
wpływem napromienienia UV-C.
RYC.4. Kinetyka degradacji białka IkBa (Western-blot) w komórkach
linii HCT116 stymulowanych cytokiną TNFa (15-min).
UV = 20J/m2
IR = 4 Gy
RYC.3. Akumulacja białka p53 (Western-blot) w komórkach linii HCT116 pod
wpływem napromienienia UV-C lub IR.
TNFa = 10ng/ml
Analiza wpływu promieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na aktywację
szlaku NFkB i ekspresję wybranych genów zależnych od NFkB
Układ doświadczalny:
K
lub
TNFa = 10ng/ml
UV = 20J/m2
IR = 4Gy
Wykonane analizy:
 identyfikacja genów indukowanych przez TNFa
(profil ekspresji – macierz QRT-PCR)
 ilościowa analiza zmian poziomu wybranych
genów (QRT-PCR)
 analiza kinetyki degradacji inhibitora
IkBa (Western-blot)
 analiza obecności aktywnego NFkB w jądrze
komórkowym (EMSA)
Wybrane geny:
 Podjednostki czynnika NFkB: geny NFKB1 i REL
 Białka regulujące ścieżkę NFkB: geny NFKBIA, BCL3, TNFAIP3
 Geny odpowiedzi komórkowej prozapalnej (TNFA, IL1A, IL8, LTA )
i proprzeżyciowej (JUN)
Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie hamuje aktywację NFkB i obniża poziom
ekspresji genów zależnych od NFkB w komórkach stymulowanych przez TNFa;
efekt niezależny od statusu białka p53
RYC.1. Kinetyka zmian poziomu białka IkBa (Western-blot) w komórkach
poddanych kombinacji stymulacji cytokiną TNF a i promieniowania UV.
Przykładowa analiza przeprowadzona 1h i 6h
po stymulacji cytokiną TNFa
RYC.2. Detekcja aktywnych form NFkB (test EMSA) w ekstraktach jądrowych
z komórek napromieniowanych UV i stymulowanych cytokiną TNFa (wynik testu
przeprowadzonego przez dr Natalię Kashchak).
Analiza wpływu czasu napromieniowania i aktywacji ścieżki zależnej od p53 na
ekspresję wybranych genów zależnych od NFkB
Układ doświadczalny:
TNFa = 10ng/ml
UV = 20J/m2
Wykonane analizy:
 ilościowa analiza zmian poziomu wybranych genów zależnych od NFkB (QRT-PCR)
Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresji genów zależnych
od NFkB, indukowanych TNFa w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji;
efekt niezależny od statusu białka p53
p<0,01
(dla wersji eksperymentalnych UV/TNF)
RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8 (QRT-PCR) w punkcie czasowym
1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116.
Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych
(wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego
18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach
eksperymentalnych).
Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie obniża poziom ekspresji genów zależnych
od NFkB, indukowanych TNFa w sposób zależny od punktu czasowego ekspozycji;
efekt niezależny od statusu białka p53
p<0,01
(dla wersji eksperymentalnych UV/TNF)
RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3 (QRT-PCR) w punkcie
czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii
HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych
(wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego
18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach
eksperymentalnych).
Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresji
genów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa;
efekt zależny od statusu białka p53
p<0,01
(dla wersji eksperymentalnych UV/TNF)
RYC.3. Poziom ekspresji genu IL8 (QRT-PCR) w punkcie czasowym
1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii HCT116.
Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych
(wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego
18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach
eksperymentalnych).
Pre-ekpozycja komórek na promieniowanie prowadzi do oscylacji poziomu ekspresji
genów zależnych od NFkB, indukowanych TNFa;
efekt zależny od statusu białka p53
p<0,01
(dla wersji eksperymentalnych UV/TNF)
RYC.4. Poziom ekspresji genu TNFAIP3 (QRT-PCR) w punkcie
czasowym 1h po stymulacji cytokiną TNFa w komórkach linii
HCT116. Przedstawiono wartości średnie z 3 powtórzeń technicznych
(wynik analiz odniesiono do poziomu ekspresji genu referencyjnego
18S rRNA analizowaniego w tych samych warunkach
eksperymentalnych).
Podsumowanie
Komórkowa odpowiedź na promieniowanie jest modulowana przez sekwencję
czasową aktywacji ścieżek sygnałowych zależnych od czynników NFkB i p53

Napromienienie komórek poprzedzające stymulację cytokiną TNFa
 hamowanie aktywacji ścieżki NFkB i osłabienie ekspresji genów
zależnych od NFkB – niezależnie od p53
 oscylacje poziomu genów zależnych od NFkB – zależnie od p53