Transcript PPT

VARIASI GENETIK EMPAT VAR. PADI
UNGGUL DENGAN ANALISIS RAPD
MENGGUNAKAN 2 PRIMER OPR
OLEH :
Panagal M*., John B*., Arun K.**, Ali A.*** DKK.
*Dept. BIOTEK. LINGK., Plant Science Univ. BHARATHIDASAN, TAMIL NADU, INDIA.
**Dept. BIOTEKNOLOGI, PERG. TINGGI Marudhu Pandiyar, TAMIL NADU, INDIA.
*** Dept. Kimia, Univ. Nasional PUKYONG, BUSAN KOREA SELATAN.
Sumber : ARPN Journal Of Agricultural and Biological Science
Vol. 5, No. 4, July 2010
Dikaji kembali :
BAMBANG SURYOTOMO
(Surakarta, 28 Juni 2013)
(TUGAS BIOMOL & REKAYASA GENETIKA)
RINGKASAN-1
1. Untuk mengetahui keanekaragaman Genetik 4
Genotipe Padi (Oryza sativa ) digunakan
Marker (Penanda) acak RAPD.
2. Genom DNA Padi (O. sativa ) diisolasi dari
daunnya,
dan
dihitung
menggunakan
Spktrofotometer sinar UV serta diampliflikasi
dgn menggunakan Primer OPR1 dan OPR2.
3. Dgn OPR1, Genom DNA 4 Genotipe Padi yg
diamplifikasi, memberikan fragmen yang NonPolymorfik (tidak dapat membedakan dari
keempatnya).
RINGKASAN-2
4. Dgn OPR2, Genom DNA dari 4 Genotipe yg diamplifikasi, menujukkan fragment yg Polymorfik.
(dapat membedakan dari keempatnya).
5. Dgn menggunakan Software Jarak Genetik Nei’s
(1978) dapat ditentukan variasi kekerabatan
Genotipe padi yg diuji.
6. Kekerabatan Genotipe padi yg diuji secara berurutan
adalah: ADT38, ASD16, IR20 dan PONNI (Gb.4)
7. Dari hasil tsb dapat digunakan sebagai bahan
pertim-bangan untuk menghasilkan Hibrida dgn
Heterosis yang maksimum (yg diinginkan).
PENDAHULUAN-1
• Beras mrpk tan.penting di dunia, menyediakan banyak kalori.
Saat ini 90% beras diproduksi dan dikonsumsi di Negara-2
Asia (Parantha-man et al., 2009).
• Di India, dalam tahun 2003-2004, 87 juta ton beras, yg diproduksi dari daerah 42,41 juta ton (James Martin, 2007).
• Permintaan beras diperkirakan pd thn 2010, 100 juta ton dan
akan meningkat menjadi 140 juta ton pd thn 2025 (Singh,
2004).
• Beras memp. Genom terkecil dr semua jenis cereal; 430
juta Nukleotida, dapat menjadi model genom tanaman
berbunga
PENDAHULUAN-2
1. Genotipe ADT 38
 Adaptip pada wil.dgn Irigasi yg tidak teratur
 Tahan thd embusan angin, tahan belalang,
Gall midge, Daya hasil = 58kw/ha
2. Genotipe ASD 16
 Toleran salinitas, cenderung tahan Wereng
coklat, kutu busuk.
 Daya hasilnya 56 = kw/ha
PENDAHULUAN-3
3. PONNI
 Tahan thd hama bakteri daun, Virus tungro,
penggerek batang
Daya hasil 45 kw/ha.
4. IR 20
Tahan thd hama bakteri daun, Virus tungro,
penggerek batang
Daya hasil 45 kw/ha.
PENDAHULUAN-4
• Saat ini PCR (Polymeration Chain Reaction)
berbasis RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) lebih murah & sederhana dibandingkan RFLP (Retriction Fracment Length
Polymorphism) (William et al., 1990).
• Keuntungan RAPD, sederhana, DNA sedikit,
mampu meregenerasi polymorfisme.(Yu& Ngu
yen, 1994). Memp.Primer Universal, butuh
primer sedikit unt. Identifikasi polymorfisme
suatu Spesies. Krn itu penel. Ini dilakukan
Bahan dan Metoda-1
1. Bahan Tanaman



Empat Var. biji O. sativa yi, PONNI, ADT38, IR20, & ASD 16,
Diperoleh dari Bank-benih dr Univ. Pertanian , India.
Benih ditanam dalam pot pada kondisi laboratorium.
2. Isolasi Genom DNA
 Metode Isolasi menurut Sambrook et. Al., (1989) dgn sedikit
modifikasi. Contoh daun tan. (0,5 g/kg) digiling dgn 1 ml buffer yg
homogen.
 1 ml sample lysis kmd disentrifugasi pada kecep.8000 rpm selama
10 menit pada suhu 4⁰ C. Supernatan dipindahkan dalam tabung
baru berukran 1,5 ml dan dicampur dngn Fenol, Isoamyllalcohol
disentrifugasi pada 1.000 rpm selama 10 Menit pada suhu 4⁰
Bahan dan Metoda-2
3. Gel Elektrofrensis
15 µl DNA dicampur dgn Pewarna bermuatan
(Genei, Bangalore), dan diloading pd 0.8% Gel
Agarosa.
Genomik DNA dielektroforensis pd 75 Volt
selama 1 jam, dan Amplifikasi PCR dilakukan
selama 1-2 jam pd 55 Volt.
Gel diwarnai dgn Etidium Bromida dan disinari
dengan UV untuk visualisasinya (Bend2nya)
Bahan dan Metoda-3
4. Penghitungan DNA dgn Spektrofotometer UV
 Sampel DNA yg diisolasi diukur dgn Spektrofotometer sinar
tampak UV. Dgn absorbansi pada 260-280 nm, maka Konsentrasi
DNA dapat ditentukan.
 Konsentrasi DNA = OD260 x 50 µg/ml x faktor pengenceran.
5. Primer
 Primer Acak disintesis di Genei Bangalore.
 Panjang masing2 Primer 10 bp (pasang basa), dgn urutan sequen
sbb:
Primer
Sequence
OPR1
GCACCGATCT
OPR2
GATTCCGCGG
Bahan dan Metode-4
6. Reaksi RAPD-PCR
 Reaksi amplifikasi dilakukan men. Saker et al. (2005) dgn
sedikit modifikasi, yg berisi Template (1.5 µl), Primer (1 µl),
Campuran Enzim induk (12,5 ml) dan Air Milli Q (10 ml).
 Amplifikasi dilakukan pd siklus termal DNA pd profile PCR;
Pre denaturasi pd 94⁰C selama 5 menit, 36 siklus pd 94⁰C
selama 30 dtik, 36⁰C selam 30 dtk dan 72⁰C selama 1 menit
dan akhir ekstensi pd 72⁰C selama 5 menit, produk akhirnya
diamplifikasi pd 4⁰C.
 15 µl produk (DNA) diamplifikasi pd 2% Gel Agarosa dgn
Ethidum Bromida. Elektroforensis tampak pd sinar UV
Bahan dan Metoda-5
7. Analisis Data
 Analisis dilakukan dgn membandingkan Pola RAPD
setiap individu Genom DNA sempel.
 Fragmen yg memberikan marker jelas/kuat untuk
setiap individu diberi skor shg muncul pd grafik data.
 Pola pita Gen dievaluasi berdasarkan Jarak Genetik
Nei’s (1978) dgn Program Free-Tree-Free (Pavlicek
et al., 1999).
 Pohon Filogenetic dibuat dengan bantuan Software
Hasil dan Pembahasan-1
1. Genom DNA padi yg diisolasi dan diuji dg.
Elelektroforensis, menghasilkan pita yang
beragam dgn konsentrasi 3,8-93 ng.(Gbr. 1).
2. Dgn Primer OPR1 Genom 4 Var yg diuji
menghslkan 27 pita yg memp. 300-1600 ps
basa (bp),Primer tsb Tidak Bisa membedakan
genom ke-4 Var. Padi yg diuji (dgn Primer
OPR1 Amplifikasi Genon DNA Padi yg diuji,
menunjukkan Non Polymorphic, pola pita
identik, gbr. 2).
Hasil dan Pembahasan - 2
3. Dgn Primer OPR2, hsilnya lebih informatif dibanding Primer OPR1, artinya dgn Primer
OPR2 dapat menunjukkan Pola pita yg berbeda dari 4 Var. Genom padi yg diuji. (gb.3).
4. Analisis RAPD dgn Primer OPR2 yg memp.
sequence GATTCCGCGG dpt digunakan untuk
membedakan pola pita genom DNA padi yg
diuji dan menganalisis hub. kekerabatan (dgn
menggunakan Dendrogram UPGMA, Gb. 4).
Ilustrasi PCR berbasis RAPD
Ilustrasi Genomic DNA
Hasil Analisa Elektroforensis GENOM DNA
Padi (Oryza sativa) yg diuji (Gb. 1)
1.
2.
3.
4.
ADT38 = 89 ng
ASD16 =100 ng
PONNI = 88.3 ng
IR20 = 93 ng
Amplifikasi dgn OPR-1
(Non Polymorfic) (Gb.2)
Amplifikasi dgn OPR1 ‘tdk bisa’ membedakn antar Genom DNA
M
1
2
3
4
= 1 Kb DNA Ladder
= ADT38
= ASD16
= IR20
= PONNI
Amplifikasi dgn OPR-2
(Polymorfic) (Gb.3)
Dgn Primer OPR2, dpt membedakan antar Genotipe Padi
M = 100 bp DNA Ladder
1 = ADT38
2 = ASD16
3 = IR20
4 = PONNI
HUBUNGAN KEKERABATAN BERDSRKAN JARAK
GENETIK 4 GENOTIPE PADI (Oryza sativa) (Gb.4)
Gb. 4. Dendrogram UPGMA Nei’s(1978), mengukur jarak
genetic diantara 4 sampel O. sativa hasil analisis RAPD
Hubungan kekerabatan (jarak genetic) populasi
EMPAT GENOTIPE. Padi (Oryza sativa ), tampak berbeda
diukur berdasar ‘Jarak genetic Nei’s (1978)’.
PONNI
PONNI
IR20
0.39138
IR20
0.39138
ADT38
1.77767
1.60944
ASD16
1.02564
1.95601
ADT38
ASD16
1.77767
1.02564
1.60944
1.95601
0.8574
KESIMPULAN-1
1. Dgn analisis PCR berbasis RAPD dpt menduga
keragaman dan hubungan genetik antar
spesies dari Oryza sativa
2. Dgn dua Primer (OPR1 & OPR2) dpt mengungkap keragaman genetic Genotipa Padi
(Oryza sativa ).
3. Urutan keragaman genetik padi yg diteliti adl:
ADT38, ASD16, IR20 dan PONNI. (dari pohon
Filogenik)
KESIMPULAN-2
4. Jarak genetik terjauh terdapat antara Genotipa ASD16 dgn IR20 (1.95601).
5. Jarak genetik terdekat terdpt pada Genotipa
PONNI dgn IR20 (0.39138).
6. Analisis dgn PCR berbasis RAPD merupakan
penelitian yg murah dan terbaik mengetahui
keragaman Genetik Spesies baru.
PENUTUP
Pertanyaan :
1. Mengapa data fenotipe (daya hasil, tingkat
serangan) tidak disertakan dalam analisis?
Mungkin hasil lebih memp. Arti bagi Breeder.
2. Genotipe Uji yg digunakan sedikit, kalau
genotipe ditambah, mungkinkah Primer OPR1
yg digunakan dapat Polymorfis?.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb.