Transcript File 4 - Altervista
Misurazione e uso di anticorpi Misurazione delle funzioni dei linfociti T
Misurazione e uso di Abs
• • • • • • Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia d’affinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso
Citometria a flusso
Basi della Citometria a Flusso
Fluidica Ottica Elettronica
• Cellule in sospensione • passano in singola fila attraverso • un volume illuminato dove esse • riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza • che viene raccolta, filtrata e • convertita ad un valore digitale • che viene inviato al computer
Fluorocromi utilizzati più comunemente Linee Laser Comuni
350
300 nm 400 nm 457
488 514
500 nm
610
600 nm
632
700 nm
Coniugato PE-TR Texas Red Ioduro di Propidio Etidio Bromuro PE (ficoeritrina) FITC (fluoresceina) Acido cis Parinarico
Schema generale della camera di flusso di un citofluorimetro Iniettore Fluido di rivestimento
Cella di Flusso
Segnale di Fluorescenza Raggio laser focalizzato
Granulocito Linfocito Monocito
Rilevamento dei parametri fisici
Filtro Dicroico/Specchio a 45 gradi Sorgente luminosa Luce trasmessa Luce Riflessa
Laser
Scatter frontale
(Forward Angle Light Scatter, FALS)
Granulocito
Sensore per il FALS
Linfocito Monocito
• Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” nella
direzione frontale
(ovvero lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del
forward scatter
• L’ intensità del forward scatter è proporzionale alla
dimensione
,
forma
ed
omogeneità
ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)
Laser
Monocito
Scatter laterale
(90 Degree Light Scatter)
Granulocito Linfocito
Sensore FALS Sensore per il 90 °LS
• Quando si utilizza una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del
side oppure 90°scatter
• Anche l’ intensità del side scatter è proporzionale alla dimensione, forma ed
omogeneità
ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)
• Il
Forward Scatter
tende ad essere più sensibile alle proprietà della superficie cellulare delle particelle del Side Scatter – può essere usato per distinguere cellule
vive
da cellule
morte
• Il
Side Scatter
tende ad essere più sensibie alle inclusioni presenti all’interno della cellula del forward scatter – può essere usato per distinguere cellule
granulate
da cellule
non-granulate
Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico
GRANULOCITI MONOCITI LINFOCITI
Nuclei di linfociti
normali
o
apoptotici
Complex or Boolean Gating
With two overlapping regions, several options are available: R1 R2
Boolean Gating
Region 1 and Region 2:
R2 Es pres sione di molec ole CD86 (B7.2) 3% M1 Un-treated 93% M1 LPS 10 µg/ml
Cecilia 2
(exp. M) - 1 3 febbraio 20 04 D1 : batteri = 1:75 sp in 90 m in. inc ubazione
Borde tella Pertus si s Borde tella Para-pertus si s
B7.2
MHC II CD 40
T cells CD11c CD11b B cells
Analisi citofluorimetrica
pDC CD11c+ CD11b DC CD11c+ CD11b+
FL1-H
FL1-H : CD11b FL2-H : CD11c Macrophages CD11c CD11b+
Analisi del ciclo cellulare
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…
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apoptosi
analisi al citofluorimetro
singole
Il “sorting” cellulare
FACS : F luorescence A ctivated C ell S orting
Cellule singole separate dentro diverse provette 488 nm laser FALS Sensor Fluorescence detector + Piastre cariche elettricamente
Jet-in-Air Freq. (Hz) Laser Crystal Electrode Nozzle Optics Electronic Amp. (v)
Jet-in-Air Freq. (Hz) Laser Crystal Electrode Nozzle Optics Electronic Amp. (v)
Jet-in-Air Freq. (Hz) Laser Electrode +/- 190 V + + + + + + + + + Crystal Nozzle Fluorescence Delay Time Optics Electronic Break-off Point Amp. (v)
Jet-in-Air - 3000 V + + _ _ + 3000 V
Analisi pre-sorter
Macrofagi peritoneali CD11b positivi
Gating
Macrofagi peritoneali CD11b positivi
Sorted
CD11b HIGH sorted CD11b INT. sorted
Misurazione e uso di Abs
• • • • • • Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia d’affinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso
ELISA
•Legame diretto con l’Ag •Sandwich
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ELISA sandwich QuickTime™ e un decompressore TIFF (LZW) sono necessari per visualizzare quest'immagine.
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ELISPOT
Western blotting
Cromatografia d’affinità
Magnetic sorting
miniMACS
Microscopia ad immunofluorescenza .
.
.
.
.
.
Immuno Staining (anti-occludina)
polilisina/vetrino conc. finale di Poli-L. 0,5 mg/ml, in H 2 O 20 min. RT 2 lavaggi con H 2 O asciugare bene
PREPARZIONE DEI CAMPIONI
Seminare 1,5 x 10 5 cells/vetrino, in 70 µl di terreno NO siero Incubazione, 15 min 37 ｰ C (incubatore) Controllare al microscopio
FISSARE LE CELLS
Aspirare il surnatante Aggiungere 70 µl di PFA1%, 60 min a 4 ｰ C Lavare tre volte con PBS 1X (RT)
A questo passaggio posso conservare i campioni (in PBS, 4
ｰ
C)
1 COLORAZIONE
Aspirare il PBS Permeare, 0,05%TRITON X-100 in PBS, 5 min on ice.
Washing 3X con PBS Blocking con 3%BSA in PBS, 15 min RT Washing 3x con PBS
Primary Ab, anti-occludina
(
rabbit
, 1 mg/ml, ZYMED, cat. N. 71.1500), usare 10 µg/ml finale in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino 1 h on ice Washing 3x con PBS
Secondary Ab,
a
-rabbit, IgG, Cy3-conjugated (donkey
Jackson Cod. n. 711.166.152). Suggested dilution 1:700, in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino.
30 min on ice, al buio.
Washing 3x con PBS Montare il vetrino (coverslip) su portaoggetti usando 5-6 µl di moviol 30 min RT, buio Vetrino a – 20 ｰ C.
2
Misurazione delle funzioni dei linfociti T
A differenza della misurazione della risposta anticorpale umorale, l’immunità mediata dalle cells T è tecnicamente più difficile da misurare.
Le cells T non secernono prodotti in grado di legare l’antigene, per cui non esiste per questo tipo di risposta nessun semplice saggio di legame
Studio di funzioni linfocitarie
Le funzioni del linfociti T possono essere misurate in 3 modi: 1. Uccisione del bersaglio cellulare 2. Attivazione delle cellule APC 3. Produzione di citochine
Metodiche
1. saggio di citotossicità 2. saggio di proliferazione 3. misurazione di citochine
Attività citotossica: Rilascio di cromo da cellule bersaglio
Proliferazione antigene-specifica delle cellule T
Misura citochine prodotte: intracellular staining
Intracellular staining
1-
cellule in piastra a concentrazione molto alta ( 5x10 5 cells/ml)
8-
lavare con 2 ml di
PBS-FCS 5%
2-
aggiungere
Brefaldine (BFA)
10 µg/ml
9- permeare:
risospendere le cells in 500 l PB (PBS+FCS 5%+0.5% saponina). 10 min RT
3-
raccogliere le cellule e suddividerle nei tubi (1-1,5x10 6 cells/ml/sample)
10-
aggiungere 1 ml
PB
e centrifugare 1200 rpm x 5 min
4- blocking
10 min RT : incubare 100 l di
PBS-FCS 5%
11-
risospendere in 100 l di
PB+siero
per
blocking
(1:25)
5-
aggiungere
anticorpo
di superficie
12-
aggiungere
anticorpo
intracellulare
6-
lavare 4 volte con 2 ml
PBS-FCS 5%
13-
incubare 30 min RT al buio
7- fissare
con 500 l/tubo di
2%
e incubare 10 minuti RT
paraformaldeide
14-
lavare 2 volte con
PB
15-
lavare 2 volte con
PBS-FCS 5%
Misura citochine prodotte: cytokine capture
CFSE
5- or 6-(N-Succiimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'-diacethylfluorescein CFSE is cell membrane permeable and readily accumulates inside of viable cells where it covalently attaches to intracellular proteins. Hydrolyzed CFSE emits fluorescence and covalently-attached fluorescein molecules seldom leak from cells. CFSE-labeled cells can be monitored over several weeks in vivo. Therefore, CFSE is utilized for viable cell detection as well as for the long-term observation of cell activities by fluorescent microscopy. The excitation and emission wavelengths of CFSE-labeled cells are 500 nm and 520 nm, respectively. QuickTime™ e un decompressore TIFF (Non compresso) sono ne cessari per visuali zzare quest'immag ine.
T cell proliferation CFSE staining
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Allogeneic CD8 T cell proliferation No DCs CD8 WT IL-2 -/ 48 h 72 h FSC