Transcript BTM GUARINI N°5 - e

IMMUNOFENOTIPO
Citometria a flusso
Identificazione
popolazione
cellulare
Caratterizzazione
popolazione
cellulare
Quantificazione
ago-aspirato midollare, linfonodale, sangue periferico
liquor, versamenti
•
•
•
•
linea di appartenenza
stadio di differenziazione
asincronia maturativa
presenza di aberrazioni antigeniche
Intensita’ di espressione di un determinato Ag sulla
cellula (MIF e ABC)
L ’ esecuzione di una corretta analisi citofluorimetrica su
popolazioni neoplastiche NON PUO ’ PRESCINDERE DALLA
CONOSCENZA DELLE CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE
della popolazione da esaminare e dal sospetto diagnostico
IMMUNOFENOTIPO
Citometria Vs Citometria a flusso
Citometria
• e’ possibile localizzare un antigene
•scarsa capacita’ di analizzare piu’ parametri
•scarsa capacita’ di valutare i diversi sottotipi cellulari
•valutazione morfologica quantitativa e qualitativa
Citometria a flusso
• e’ possibile analizzare moltissime cellule in un tempo
breve
•capacita’ di analizzare piu’ parametri
•approccio multiparametrico quantitativo e qualitativo
Citofluorimetria: definizione
Tecnica multiparametrica che misura le caratteristiche fisiche e/o chimiche di cellule in
sospensione all’interno di un fluido di trasporto
FLUIDICA
cellule in sospensione
passano in singola fila attraverso
OTTICA
un volume illuminato dove esse
riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza
che viene raccolta, filtrata e
convertita ad un valore digitale
ELETTRONICA
che viene inviato al compiuter
Camera di flusso (componente fluida)
Citofluorimetro: principi
Citofluorimetro: principi
SPETTRI DI FLUOROCROMI
Analisi citofluorimetrica
Perche’ si guarda FSC Vs SSC
Dato che FSC “ dimensione cellulare ” e SSC “ struttura interna ” , la
misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi
cellulari di una popolazione eterogenea di cellule
CITOGRAMMA NORMALE
ESEMPIO DI CITOGRAMMA
NORMALE: IL CD45
CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO, ovvero ESPRESSO
CON CARATTERISTICA INTENSITA’ SU LEUCOCITI MA
ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU CELLULE
BLASTICHE
CD45: citogramma
diCD45
un midollo
Perche’ si guarda
Vs SSC normale
Dato che SSC “ dimensione cellulare ” e CD45 ” pan leucocitario ” la
misurazione combinata dei due parametri permette di distinguere diversi tipi
cellulari di una popolazione eterogenea di cellule
1-LYMPH
2-MONO
4-BLAST
5-ERY
3-GRAN
Maturazione mieloide: SIDE SCATTER
Aberrante
CD45
Normale
SSC
NORMALEPATOLOGICO
ESEMPIO DICITOGRAMMA
CITOGRAMMA
(LEUCEMIA ACUTA)
CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO,
ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’
SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU
CELLULE BLASTICHE
NORMALEPATOLOGICO
ESEMPIO DICITOGRAMMA
CITOGRAMMA
(LEUCEMIA ACUTA)
CD45: ANTIGENE PAN LEUCOCITARIO,
ovvero ESPRESSO CON CARATTERISTICA INTENSITA’
SU LEUCOCITI MA ESPRESSO IN MODO ANOMALO SU
CELLULE BLASTICHE
STEM CELL
Lymphoid progenitor
CD117
HLA-DR
CD90
TdT
CD38
CD19
CD10
CD34+/CD22
cCD79a
TdT
CD38
sCD22
CD24
B lymphocite
cCD79a
CD117
MPO HLA-DR
CD34+
CDw123
AC133
CD33
CD38
CD117
HLA-DR
CD90
CD38
CD34+
B-progenitor
CD34-
Myeloid progenitor
CD34+
Cortical thymocyte
CD34-
cCD3
CD1a
CD2
CD5
CD7
CD4
CD8
CD38
T lymphocite
CD19
CD20
CD34CD22
sCD79b
FMC-7
CD38
sIgM
Ig kappa
Ig lambda
sCD3
CD7
CD2
CD5
CD4
CD8
TCR a/b
TCR g/d
CFU-GM
CD34+
BFU-E/CFU-E
CD33
CD13
Myeloblast
CD34-
CD13
CD33
CD15
CD14
CD11b
CFU-MK
CD34-
CD61
CD41
CD42a
CD34-
CD36
CD71
Gli-A
MATURAZIONE LINFOIDE B
MATURAZIONE LINFOIDE T
Schema di differenziazione delle cellule B normali
Schema di differenziazione delle cellule B normali
Sangue midollare da donatore sano
Vs
LAL B
SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE B
Marcatori B-lineage
SUPERFICIE
Schema di differenziazione delle cellule T normali
CD5
CD2
CD3
CD4
CD8
CD3
CD5
CD3
CD8
CD3
Il concetto “EMPTY SPACES
CD4
CD2
SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE LINFOIDE T
Marcatori T-lineage
SUPERFICIE
IMMUNOFENOTIPO
Utilizzo di 6-8 colori per la identificazione di antigeni di superficie,
citoplasmatici e nucleari; possibilita’ di studiare qualsiasi sospensione
cellulare
Identificazione dei “leukemia-associated”
Phenotypes (LAIP)
Firma fenotipica paziente-specifica
Utilizzo delle aberrazioni specifiche sia per la diagnosi che per
lo studio della Malattia Minima Residua
IMMUNOFENOTIPO
Permette di IDENTIFICARE,QUANTIFICARE E CARATTERIZZARE gli elementi
acquisiti (linea di appartenza, stadio di differenziazione, presenza di aberrazioni,
intensita’ di espressione antigenica MIF e ABC)
In caso di antigeni specifici l ’ immunofenotipo può rispondere a
domande su diagnosi, prognosi e malattia residua minima
Marcatori cellulari: la nomenclatura CD
Si considera membro di un Cluster Differentiation un marcatore di superficie
che:
•identifica un particolare tipo cellulare o un certo stadio differenziativo
•ha una struttura biochimica definita
•è riconosciuto da un gruppo di MoAb diversi
ESPRESSIONE DI UN ANTIGENE
MIF (Mean Fluorescence Intensity)
MIF
La Mean Intensity Fluorescence è un
valore fornito dal citofluorimetro e
rappresenta il rapporto tra la
fluorescenza del campione e quella
dell’isotipo; e’ proporzionale ai siti di
legame
MIF= intensita’ media M2/intensita’ media M1
FL2-H
FL2-H
FL2-H
ABC (Antibody Binding Capacity)
ABC
Antibodies Bound per Cell è un valore che si
ottiene confrontando l ’ espressione di un
antigene con una curva di riferimento
costruita con rapporti noti tra molecole di
antigene/valore di fluorescenza
Area di calcolo
Studio citofluorimetrico della MMR
COSA si va a cercare?
Assetti immunofenotipici leucemia-associati
Espressione Ag “ectopica”: es. blasti di LAL-T a livello midollare, blasti TdT+ a livello
extra-midollare
Ag aberranti: es. blasti di LAL della linea B con Ag T o mieloidi; blasti di LMA con Ag T
oB
Espressione Ag asincrona: es. CD19/CD34/TdT/cyt.m in LAL B, CD34/CD56 o CD15 in
LAM
Diversa entità di espressione Ag: es CD10, CD19, TdT in LAL B
Metodi di analisi della Malattia Minima residua nelle Leucemie Acute
100
Morphology
Southern blot
Cytogenetic
10-1
10-2
FISH
10-3
10-4
Flow cytometry
10-5
10-6
PCR
10-7
Con le tecniche convenzionali di citomorfologia è possibile identificare l'1-5% di
popolazione di cellule normali
cellule leucemiche in una
La sensibilità aumenta in modo significativo (fino a 10-4) quando vengono applicate tecniche immunologiche
utilizzando anticorpi diretti contro antigeni di differenziazione delle serie linfoide ed enzimi selettivamente
espressi negli stadi più precoci dell'ontogenesi
Grazie alla combinazione di tre metodologie (biologia molecolare, cariotipo, FCM) tutti i pazienti possono essere
stratificati in più gruppi di rischio appropriato per la ripartizione terapia basata sul rischio
Misura della fluorescenza: utilità
Le cellule possono essere identificate grazie alle loro
molecole di superficie e relativo specifico marker (CD,
“cluster di differenziazione”)
Anticorpi monoclonali per specifici antigeni CD possono
essere utilizzati per identificare il tipo di cellula
L’anticorpo monoclonale può essere coniugato con un
Fluorocromo (FITC, PE, Tandem ECD, PC5………) e si può
eseguire un test di immunofluorescenza diretta
STEM CELL
Lymphoid progenitor
CD117
HLA-DR
CD90
TdT
CD38
Myeloid progenitor
CD34+
CD34+
CD117
MPO HLA-DR
CD34+
CDw123
AC133
CD33
CD38
CD117
HLA-DR
CD90
CD38
CFU-GM
CD34+
BFU-E/CFU-E
CD33
CD13
Myeloblast
CD34-
CD13
CD33
CD15
CD14
CD11b
CFU-MK
CD34-
CD61
CD41
CD42a
CD34-
CD36
CD71
Gli-A
Modificazioni fenotipiche durante la normale
differenziazione neutrofila
Mieloblasti
Promielociti
Mielociti
Metamielociti
Neutrofili
CD15
CD13
CD13
CD64
MPO
103
CD65
CD33
CD35
CD11b
102
CD1
6
101
CD34
HLA-DR
CD117
CD54
CD10
SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE
la granulopoiesi
SCHEMA SEMPLIFICATO DELLA DIFFERENZIAZIONE MIELOIDE
la monocitopiesi
Maturazione mieloide
I
II
III
IV
Myelo/monoblast
Promyelocyte
Myelocyte
CD34
CD117
HLA-DR
CD13++
CD33++
CD117
CD13++
CD33++
CD15
CD13 dim
CD13 dim
CD15
CD11b*
Metamyelocyte
Band cell
CD13
CD33 dim
CD15
CD11b
CD16*
CD34/CD117/CD45/CD13.33
CD16/CD13/CD45/CD11b
CD15/CD11b/CD45/CD33
V
Neutrophil
CD13++
CD33
CD15
CD11b++
CD16++
CD45**
Adherence to
Fibrinogen,
Chemotaxis…
C
D
11
b
Maturazione mieloide
Neutrofilo
CD16
CD16/CD11b/CD45/CD34
Maturazione mieloide
STEM CELL
Lymphoid progenitor
CD117
HLA-DR
CD90
TdT
CD38
CD19
CD10
CD34+/CD22
cCD79a
TdT
CD38
sCD22
CD24
B lymphocite
cCD79a
CD117
MPO HLA-DR
CD34+
CDw123
AC133
CD33
CD38
CD117
HLA-DR
CD90
CD38
CD34+
B-progenitor
CD34-
Myeloid progenitor
CD34+
Cortical thymocyte
CD34-
cCD3
CD1a
CD2
CD5
CD7
CD4
CD8
CD38
T lymphocite
CD19
CD20
CD34CD22
sCD79b
FMC-7
CD38
sIgM
Ig kappa
Ig lambda
sCD3
CD7
CD2
CD5
CD4
CD8
TCR a/b
TCR g/d
CFU-GM
CD34+
BFU-E/CFU-E
CD33
CD13
Myeloblast
CD34-
CD13
CD33
CD15
CD14
CD11b
CFU-MK
CD34-
CD61
CD41
CD42a
CD34-
CD36
CD71
Gli-A
CD34
Gate Totale
CD34 pos/CD45 pos =0.58%
Midollo donatore sano
Gate Totale
CD34 pos/CD45 pos =0.7%
Aferesi donatore sano
Gate Totale
CD34 pos/CD45 pos =0.3%
Sangue cordone ombelicale