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2007 Desarrollo Profesional
Transformación de
pGLO™ y Purificación
de la Proteína GFP
(Green Fluorescent
Protein)
Instructores
Essy Levy, M.S.
Coordinadora de Programas de Hughes
Scholars
UCSD, San Diego CA
Julie Mathern
BioEducation Product Manager
Bio-Rad Laboratories, Hercules CA
¿Para que
enseñar
la
transformación
genética?
• Una herramienta poderosa para el
aprendizaje
• Parte de los estándares nacionales
curriculares
• Varias extensiones de practicas de
laboratorio
• Conexiones con el mundo real
• Conexiones con carreras científicas
académicas y en la industria
Dogma
Central de la
Biología
Molecular
ADN
ARN
Proteín
a
Característica
Conexiones
con el mundo
real
• GFP es un marcador visual
• Estudio de los procesos biológicos
(ejemplo: la síntesis de las proteínas)
• Localización y regulación de la expresión de un
gen
• Movimiento celular
• El destino celular durante el desarrollo
• Formación de los diferentes órganos
• Marcadores genéticos útiles para identificar
organismos transgénicos
Kit de
Transformación
de Bacteria
con pGLO™
Ventaja del uso del kit pGLO de Bio-Rad
• Basado en los estándares curriculares
• Currículo comprensible para las investigaciones
basadas en el proceso del cuestionamiento
• Compatible con un periodo de clase de
50 minutos
• Proporciona una clase entera de 32 estudiantes
(4 estudiantes por grupo)
• Costo económico
• Resultados exitosos en las manos de los
estudiantes
• Seguro para uso en el aula
• ¡Resultados tangibles!
Procedimiento
Transformación
Day 1
Day 2
Horario
para el Taller
de GFP
• Introducción
• Transformación de bacteria con el plásmido
de pGLO
• Inducción de la expresión de GFP con
arabinosa y la subsecuente purificación de
la proteína
Kit de
Transformación
de Bacteria
con pGLO™
¿Que es una
transformación?
Absorción de
ADN exógeno;
frecuentemente
un plásmido
circular
GFP
Lactamasa beta
Resistencia
a la
Ampicilina
¿Que es un
plásmido?
Un pedazo circular de
ADN que se replica
autónomamente
Evolucionado
originalmente en
bacterias
Puede expresar
resistencia a un
antibiótico o puede
ser modificado para
expresar una proteína
de interés
Las diferentes caras
de un plásmido
Micrografía de transmisión de
electrones
Representación Grafica
Gel de agarosa
Plásmido
pGLO
• Lactamasa Beta
-Resistencia a la
ampicilina
• La proteína GFP
(Green Fluorescent
Protein)
– Aequorea victoria
gen de medusa
• araC: Regulador
Regula la trascripción
de GFP
Transformación
con pGLO
Pared celular
GFP
Cromosoma
Bacteriano
(ADN)
Lactamasa Beta
(resistencia a ampicilina)
Plásmidos de pGLO
ADN
Bacteriano
Célula de Bacteria
Plásmido de ADN
ADN Geonómico
Regulación de
Trascripción
• Operón de
lactosa
• Operón de
Arabinosa
• Plásmidos de
pGLO
Regulación de
Trascripción
Operón ara
Operón lac
LacI
Z
Y A
ara
C
Z
Y A
araC
Y A
B A D
ARN Polimerasa
ARN Polimerasa
Z
A D
Efector (Arabinosa)
Efector (Lactosa)
LacI
B
araC
B A D
Regulación de
la expresión
del gen
Operón GFP
Operón ara
ara
C
B
A D
araC
Efector (Arabinosa)
Efector (Arabinosa)
araC
B A D
araC
B A D
Gen de GFP
ARN Polimerasa
ARN Polimerasa
araC
Gen de GFP
araC
Gen de GFP
Métodos de
Transformación
• Electroporación
– Un choque eléctrico resulta en que
la célula sea permeable al plásmido
ADN
• Cloruro de Calcio y Choque Térmico
– Las células químicamente
competentes absorben el ADN
después del choque térmico
Proceso de
Transformacion
• Suspender las colonias en la Solución de
Transformación
• Añadir el plásmido pGLO ADN
• Incubar los tubos en hielo ice
• Choque térmico a 42°C y colocar en hielo
• Incubar con caldo nutriente LB
• Extienda la suspensión por la superficie de
las placas
¿Porque es
importante cada
paso de la
transformación?
Ca++
Ca++
O
O P O
O
CH2
1. La solución de
transformación
= CaCI2
La carga positiva
del los iones de
Ca+2 neutralizan
la carga negativa
de los fosfatos del
ADN
Base
O
Azúcar
O
Ca++
O P O
Base
O
CH2
O
Azúcar
OH
¿Porque es
importante cada
paso de la
transformación?
2. Incubación en hielo
-disminuye la
fluidez de la
membrana celular
Pared Celular
GFP
3. Choque térmico
-incrementa la
permeabilidad de la
membrana celular
4. La recuperación
con LB permite la
expresión de
lactamasa beta
Lactamasa Beta
(resistencia a
ampicilina)
¿Que es el
caldo
nutriente de
LB?
• Caldo Luria-Bertani (LB)
• Un medio que contiene los nutrientes para
el crecimiento bacteriano y la expresión de
los genes de interés
– carbohidratos
– aminoácidos
– nucleótidos
– Sales
– Vitaminas
¿Crecer?
¿Brillar?
Siga el protocolo
¿En que placas crecerán
colonias?
¿Que colonias brillarán?
Medida de
Volumen