Transcript Document

Epigenetika
- metylace DNA
Metylace DNA u Eukaryot
nemetylovaná DNA: kvasinka Saccharomyces cerevisiae,
octomilka Drosophila (málo), kroužkovci, hlístice Caenorhabditis
savci: 3-8 % cytosinových zbytků, CG sekvence
(u embryonálních kmenových buněk i v non-CG kontextu)
- nízký výskyt CG v repetitivních heterochromatinových
oblastech (mutageneze)
rostliny: 25-30 % cytosinových zbytků (~ velikosti genomu)
- především v repetitivních heterochromatinových oblastech
(pravidelný výskyt nemetylovaných míst – SAR, MAR)
- u větších genomů (obiloviny) ostrovy transkripčně aktivní
DNA s nižším obsahem metC
- metC (CG) je ale i v kódujících sekvencích exprimovaných genů!!!
Mechanismus metylace DNA
- metylace bází - cytosinu a adeninu (bakterie – restrikce cizorodé DNA)
u Eukaryot je biologicky významná metylace cytosinu
na C5 purinového kruhu (u savců i hydroxymethylC)
H
H
H
N
N
O
cytosine
O
N
CH3
N
C
N
H
C*
+ SAM
CH3
H
N
T
N
+ H2O O
- NH3
thymine
5-methyl cytosine
O
N
„horký bod
mutageneze“
Metylace DNA – cílové sekvence
- symetrické (palindromatické), polosymetrické i nesymetrické sekvence:
5’ -------CG-------CHG----------C---C------G--C---- 3’
3’ -------GC-------GDC----------G---G------C--G---- 5’
(H = A, T nebo C; D = A,T,G)
Symetrické sekvence – snadné udržování při replikaci
hemimetylovaný stav je signálem pro udržovací metylaci
---------C*G ------------G C*----
----C*G------------- C*HG---------- C* ---------- G C------------ G DC-----------G -----------CG -------------CHG -----------C------------GC* -------------GDC*-----------G--------
Asymetrické sekvence – nutno neustále metylovat de novo
(principielně je ale také udržovací, pokud byla na mateřském vlákně)
- signál: metylace histonů a sRNAs
Cílová místa metylace DNA
v chromatinové struktuře/sekvenci
Preferenční metylace exonů
– souvislost s preferenčním výskytem nukleozómů na exonech
(spoludefinování přechodu intron – exon a exon – intron)
(současně zvýšený výskyt polymerázy II - zbrždění nukleozómem)
- bránění inkorporaci H2A.Z
Preferenční výskyt metC na vnější straně
nukleozómů
- souvisí s preferenčním výskytem C-G na vnější straně (stérické
důvody)
- lépe přístupný pro metyltransferázy
Předpokládaná korelace přítomnosti H2A.Z,
metylace DNA a regulovatelnosti/míry exprese
(
)
Coleman-Derr and Zilberman 2012
- metylace DNA brání inkorporaci H2A.Z
- H2A.Z nevhodný/neumožňuje stabilní expresi (house-keeping genů)
Analýzy metylace DNA
Přímé (strukturní):
- spektrofotometrie, HPLC (celkový stav)
- %metC
- anti metC protilátky (na chromozómu …)
- lokalizace metC bohatých úseků chromozómů
- pomocí restriktáz citlivých k metylaci
- detekce metC v konkrétním restrikčním místě
- hydrogensiřičitanovým sekvenováním
- přesné určení C a metC v určité sekvenci
- i v celém genomu (v kombinaci s moderními technikami sekvenování)
Nepřímé (funkční) – vztah mezi metylací a genovou expresí
- např. sledování reaktivace umlčených genů
Analýzy metylace DNA
pomocí restrikčních endonukleáz citlivých k metylaci
- štěpení, Southernova hybridizace
- PCR, elektroforéza (méně spolehlivé)
(izolace krátkých na geny bohatých fragmentů u velkých genomů - kukuřice)
A -----------C
B -----------C
CGG-----------------------------------CmetCGG--------------------------C
CGG-----------------------------------C
CGG----------------------
CGG--------------------------C
- štěpení restriktázou citlivou k metylaci cílové sekvence
A
B
elektroforéza a Southern
PCR a elektroforéza
CGG----------------------
PCR primer
A
B
Analýzy metylace DNA
1. hydrogensiřitanová modifikace,
2. shotgun sequencing
nebo PCR + sekvenace
1. denaturace
---------C*---------C--------CC---C*------C------------C--
2. modifikace Cyt na Ura
(5metC zůstává nezměněn)
---------C*---------U--------UU---C*------U------------U--
3. PCR, sekvenace (WGS)
původní sekvence
---------C---------C-------- CC---C------C------------C----------G---------G--------GG---G------G------------G--
modifikovaná sekvence
---------C---------U--------UU---C------U------------U----------G---------A--------AA---G------A------------A--
Analýza metylace u Arabidopsis
„Chromosome epigenetic landscape“
?
?
Mutace zprostředkované
metylací C
metC
G
C T
T
G
replikace
reparace
T
C
A
G
Možná role v evoluci genů:
- zdvojení sekvencí (např. po polyploidizaci) navodí metylaci
- metylace navodí reversibilní inaktivaci
- mutace metC může navodit irreversibilní inaktivaci
- kopie genu může být postupně masivně mutována
(bez selekčního tlaku)
- vznik a reaktivace genu s novou funkcí
Genom Arabidopsis - statistika
Value
Feature
DNA molecule
Chr.1
Length (bp)
Top arm (bp)
Bottom arm (bp)
29,105,111
14,449,213
14,655,898
Base composition (%GC)
Overall
Coding
Non-coding
Number of genes
Gene density
(kb per gene )
Average gene
Length (bp)
Average peptide
Length (bp)
Exons
Number
Total length (bp)
Average per gene
Average size (bp)
Number of genes
With ESTs (%)
Number of ESTs
Chr.2
Chr.3
Chr.4
Chr.5
SUM
19,646,945
3,607,091
16,039,854
23,172,617
13,590,268
9,582,349
17,549,867
3,052,108
14,497,759
25,53,409
11,132,192
14,803,217
115,409,949
33.4
44.0
32.4
35.5
44.0
32.9
35.4
44.3
33.0
35.5
44.1
32.8
34.5
44.1
32.5
6,543
4.0
4,036
4.9
5,220
4.5
3,825
4.6
5,874
4.4
2,078
1,949
1,925
2,138
1,974
446
421
424
448
429
35,482
8,772,559
5.4
247
19,631
5,100,288
4.9
259
26,570
6,654,507
5.1
250
20,073
5,150,883
5.2
256
31,226
7,571,013
5.3
242
60.8
56.9
59.8
61.4
61.4
30,522
14,989
20,732
16,605
22,885
25,498
132,982
33,249,250
105,773
Rostlinné cytosin 5-metyltransferázy
- 3 rodiny u Arabidopsis
MET1 (metyltransferase)
CMT3 a CMT2
(chromomethyltransferase)
DRM2 (a DRM1)
(domain rearranged methyltransferase)
MET1 (metyltransferase1)
- příbuzná savčí Dnmt1
- udržovací metylace symetrických CG
- asociovaná s replikací
- spoluúčast komplexu remodulujícího nukleosómy DDM1
(u heterochromatinových sekvencí)
Signál – hemimetylovaná CG sekvence
---------C*G ------------G C*----
----C*G------------- C*HG---------- C* ---------- G C------------ G DC-----------G -----------CG -------------CHG -----------C------------GC* -------------GDC*-----------G--------
CMT3 (chromomethyltransferase3)
- unikátní pro rostliny a houby (příbuzné savčím Dnmt1, ale
navíc obsahují chromodoménu = doménu interagující s metK histonu
- asociovaná především s konstitutivním heterochromatinem
(repetitivní sekvence, TE - retrotranspozóny)
- „udržovací“ metylace sekvencí CHG
- zřejmě kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein)
Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 (interakce zprostředkovaná chromodoménou)
---------C*G ------------G C*----
----C*G------------- C*HG---------- C* ---------- G C------------ G DC-----------G -----------CG ------------- CHG -----------C------------GC* -------------GDC*-----------G--------
CMT2 (chromomethyltransferase2)
- příbuzná CMT3, rovněž obsahuje chromodoménu
- asociovaná s konstitutivním heterochromatinem
- „udržovací“ metylace sekvencí CHH
- kooperace s DDM1 (nukleozómy remodelující protein)
Aktivita podmíněna dimetylací histonu H3 na lyzinu K9 –
(interakce zprostředkovaná chromodoménou)
---------C*G ------------G C*----
----C*G------------- C*HG---------- C* ---------- G C------------ G DC-----------G -----------CG ------------- CHG -----------C------------GC* -------------GDC*-----------G--------
DRM2 a 1 (domain rearranged methyltransferase)
- příbuzné savčím Dnmt3, ale mají přeskupené domény
- DRM1 – v časné fázi vývoje semen
-„udržovací metylace“ asymetrických sekvencí CHH (CHG)
(euchromatin a okraje heterochromatinu)
- regulace genové exprese, silencing
- nutná spoluúčast katalyticky neaktivního paralogu DRM3 u
Arabidopsis
Cílové sekvence jsou určeny přítomností homologních siRNA
= RNA-directed DNA Methylation (RdDM)
---------C*G ------------G C*----
----C*G------------- C*HG---------- C* ---------- G C------------ G HC-----------G -----------CG -------------CHG -----------C------------GC* -------------GHC*-----------G--------
Udržovací metylace DNA
Heterochromatin s histonem H1
- střední části dlouhých TE (kódující sekvence)
- nutná účast chromatin remodel. faktoru DDM1
- metylace řízena: H3K9me2 – CMT2, CMT3 (CHH, CHG)
metylací – MET1 (CG)
Chromatin bez histonu H1
- okraje TE, krátké TE, geny
- účast chromatin remodel. faktoru DRD1
- metylace řízena především siRNA (RdDM) – DRM2
(RdDM – iniciována na H3K9me2 a nemetyl. H3K4, viz dále u RNAi)
(- metylace CG řízena metylací – MET1)
Udržovací metylace transpozónů
Zemach et al. 2013
Demetylace DNA
1) při replikaci s vyloučením aktivity udržovacích cytosin
metyltransferáz (a histonových metyláz)
2) DNA glykosylázy
(odštěpení metylcytosinu, reparací doplněn cytosin)
ROS1 REPRESSOR OF SILENCING – somatické buňky
(k demetylaci nutný ROS3 – protein vázající RNA – sRNA ? mRNA)
DEMETER-LIKE (DML2, DML3) – somatické buňky
DME1 DEMETER – parentální imprinting (endosperm)
ros1 dml2 dml3
Demetylace DNA
rel. nárůst
metylace
ROS1 REPRESSOR OF SILENCING
DEMETER-LIKE (DML2, DML3)
(částečně zastupitelné)
- aktivní ochrana reg. sekvencí genů
(promotorů) před metylací
(příp. při řízené modulaci transkripce)
- mutace v „demetylačních“ genech
se projeví především nárustem
metylace v 3’ a 5’ UTR
metylace
WT
WT
V metylačních (metyltransferázových) mutantech je
demetylace utlumena (zpětná vazba).
Ovlivňování metylace DNA
- aplikace 5-azacytidinu – blokování aktivity MET1
- dihydroxypropyladenin (DHPA) – ovlivnění hladiny SAM
- (inaktivace genů MET1, DDM1, CMT3, …)
Projevy:
- různé: žádné až výrazné změny fenotypu (způsobené TE)
- pohlavní reverze u knotovky (andromonoecie), fenotyp
cycloidea u lnice, …
Reaktivace umlčených
transgenů 5-azacytidinem
hemiMet?
- inhibitor MET1 (5-azacytidin, AzaC)
deMet
+ AzaC
+ AzaC
Demethylated
- obnovení často jen přechodné!
Nocarová, Fischer, nepubl.
Stérické důsledky metylace DNA
- buněčná interpretace metylace DNA
•
změny na úrovni histonů
- posttranslační modifikace histonů
- SRA domény: metylace (SUVH family),
- Metyl CpG-binding d.: deacetylace (HDAC)
- zastoupení různých forem histonů (H2A.Z)
•
změna vazby dalších interagujících proteinů
- regulátorů (aktivátorů a represorů) transkripce
- proteinů zodpovědných za strukturu/modifikace
chromatinu
příklad:
MBD proteiny
(metyl-CpG-binding domain)
- rostlinné MBD proteiny nemají TRD
(transcription repression domain)
- specifita vazby je dána i dalšími
interagujícími proteiny
- kolokalizace a interakce s DDM1
- AtMBD5 interaguje i s C*HH
- MBD proteiny zřejmě interagují s
histon modifikujícími proteiny (HDAC
= histon deacetylázy)
Model komprimace chromatinu
vazbou dimerizujícího AtMBD7
proteinu
Autokatalytická smyčka
- metylace CHG (CMT3) a metylace H3K9 (KYP, KRYPTONITE)
- transkripce indukuje demetylaci H3K9me2 (IBM1)
ROS1/
ROS3
???
x
DRM2
Obdobné snížení množství H3K9me2 u mutantů
kyp a cmt3
„co je defaultní“ stav?
Metylace DNA a stav chromatinu
- přehled
- prokázána korelace hypermetylace DNA a hypoacetylace
histonů (pozdní replikace DNA)
- metylace DNA je dědičným signálem k deacetylaci histonů
a kondenzaci chromatinu
- obdobné fenotypové změny při potlačení metylace (MET1)
a deacetylace histonů (AtHD1)
- přítomnost formy histonu H2A.Z se vzájemně vylučuje s
DNA metylací!!! (typicky v promotorech house-keeping genů)
Metylace DNA a stav chromatinu
- di(tri-)metylace H3K9 (KYP) je signálem pro metylaci CHG
- metylace CHG je signálem pro metylaci H3K9
- k demetylaci H3K9 (IBM1) zřejmě dochází v souvislosti s
transkripcí Pol II
- demetylace DNA prostřednictvím ROS1 vyžaduje RNA
vazebný ROS3 (transkripce, malé RNA?)
- trimetylace H3K4 je typická pro euchromatin a vzniká v
souvislosti s transkripcí Pol II (aktivní DNA)
Udržování epigenetického stavu
– přehled
Neaktivní chromatin
- MET 1 – udržovací metylace C*G
- KYP (SUVH5,6) – H3K9me2  CMT3 - C*HG (CMT2 – C*HH)
- DRM2, (DRM1) – udrž. metylace CHH  komplement. siRNA
Aktivní chromatin
- IBM1 – demetylace H3K9  transkripce
- ROS1/ROS3, DML2, DML3 – demetC  transkripce?, sRNA?
Vzájemná provázanost metylace
DNA a struktury chromatinu
posttranslační
modifikace
a formy
histonů
metC =
modifikace
dvoušroubovice
DNA
vazba
interagujících
proteinů
TF, RNA pol.,
MBD, …
Úloha a projevy metylace DNA
- dědičná (mitoticky a částečně i meioticky) modulace
transkripce - genové exprese
- obranný mechanismus vůči invazní DNA (transpozóny)
- regulace genové exprese (ontogeneze, diferenciace a
buněčná paměť, reakce na stres)
- parentální imprinting
- modulace struktury chromatinu (příčina i následek)
- časování DNA replikace
- regulace homologní rekombinace (meiosa)
- definování hranic exon-intron
- nástroj evoluce
- genomů polyploidních rostlin (rozsáhlé změny metylace)
- nových genů (mutageneze pseudogenů)
Metylace DNA u Arabidopsis
Silná metylace v repetitivních heterochromatinových
oblastech v okolí centromery
Metylace v kódujících sekvencích genů – u více než 30 %
exprimovaných genů (metylace především u genů se stabilní
expresí – house keeping)
Metylace v promotorech – u méně než 5 % genů
(geny s vývojově a pletivově specifickou expresí)