Molekulární biologie

5.

Regulace transkripce u eukaryot

(kapitola 17)

Složitější regulace než u prokaryot kvůli velkému genomu, jaderné membráně a posttranskripčním úpravám.

Regulace genů transkribovaných PolII…

Specifické transkripční faktory

: 1. Vážou se na specifický úsek DNA v genomu (enhancery několik kb upstream nebo downstream od promotoru) 2. Kontaktují transkripční aparát (přímo či nepřímo) a dovolují polymeráze opustit promotor a elongovat.

3. Často přísně tkáňově a časově regulovaná exprese TF – nazávislá DNA vazebná a aktivační doména

Enhancery výtvářejí smyčky na DNA • • • •

Mediátor

komplex 26 proteinů (u člověka) sedící na polymeráze, místo kontaktu většiny specifických transkripčních faktorů integruje signál z různých aktivátorů a represorů a tlumočí ho polymeráze zprostředkovává vazbu specifických TF a PolII drží polymerázu připravenou na promotoru (poised state), dokuď nedostane signál z cytoplasmy k uvolnění a elongaci • CDK8 – složka mediátoru, fosforyluje CTD jako odpověď na vnější signál

Jak zabránit aktivátorům na enhanceru, aby regulovaly i vedlejší geny?

• • • •

Insulátory

sekvence DNA bohaté na GC, které rozdělují chromozom na samostatné regulační oblasti vážou několik kopií IBP proteinů (insulator binding proteins), například CTCF (CCCTC binding factor) tvoří smyčky na DNA: pouze enhancery uvnitř smyčky mohou ovlivňovat geny uvnitř, aktivita vnějších enhancerů je blokovaná zároveň působí jako heterochromatinu obrana proti šíření Jeden enhancer může regulovat i více než jeden gen, ale pak si geny navzájem kompetují.

Insulátory lze inaktivovat metylací jejich GC vazebných míst

Paternálně zděděný lokus Imprinting H19/Igf2 lokusu Maternálně zděděný lokus • • metylace cytosinů v DMR1, DMR2 a ICR u otce brání vazbě CTCF na insulátor Enhancer se váže na promotor Igf2 genu u matky se díky CTCF vytvoří regulační smyčka znemožňující enahnceru aktivovat Igf2 gen, místo toho zapne H19 gen

jaderná matrix (nuclear matrix) síť filamentárních proteinů těsně pod jadernou membránou • •

DNA na chromozomu je organizovaná do smyček

, podobně jako u bakterií (300nm struktura) bakterie 40kpb na smyčku, eukaryota 60-100kbp MAR protein (matrix attachment regions protein) • • • oblast uchyceni k matrixu (matrix attachment regions, MAR neboli scaffold attachment regions, SAR ) sekvence DNA bohaté na A/T, 200-1000bp, rozeznávají ohyb DNA způsobený v oblastech DNA s mnoha A asociuje s topoisomerázou II, kontroluje kondenzaci smyčky asociace enhancerů, chromatin remodelujících faktorů

Negativní regulace transkripce

Narozdíl od prokaryot neblokují represory nasednutí polymerázy, ale spíše aktivátorů nebo iniciaci transkripce , nebo modifikují strukturu chromatinu brání nasednutí gen pro testes specifický histon H2B u ježovky váže CTF aktivátor na CAAT box, umožní Oct1 proteinu kontaktovat mediátor a spustit transkipci

CDP

CAAT displacement protein Exprimovován pod tkáňově specifickým promotorem pouze v embryu, brání příliš brzké expresi H2B genu

Mechanismus funkce represorů u eukaryot

(G)

myoD

transkripční aktivátor genů nutných pro specifikaci svalových buněk.

bHLH protein vázající se na DNA jako heterodimer s E12 partnerem, oba mají DNA vazebou doménu ID protein může dimerizovat, ale nemá DNA vazebou doménu, myoD se nemůže vázat na DNA (v buňkách, které se nemají stát svaly) ID protein negativně ovlivňuje transkripci, aniž by se vázal na DNA!

Heterochromatin

x

euchromatin

heterochromatin hustě kondenzovaná DNA s histony, nepřístupná polymeráze a proto netranskribovaná konstitutivní fakultativní – ve všech buňkách daného organizmu – při tkáňově specifickém umlčování genů euchromatin málo kondenzovaná DNA s histony, přístupná polymeráze a transkripčním regulacím Přístupnost chromatinu transkripčním faktorům a polymeráze hraje klíčovou roli při regulaci transkripce

Epigenetické modifikace histonových konců

Konce histonů H2A,H2B,H3 and H4 vyčnívají ven z nukleosomu a jsou rozeznávány různými enzymy, které je kovalentně modifikují .

Histonový kód

Kovalentní modifikace slouží jako značky rozeznávané specifickými vazebnými proteiny , které mají vliv na kompaktaci DNA, transkripci, replikaci, rekombinaci, opravy DNA...

metylace – postupná mono, di, tri metylace http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11652

sumoylation

http://docs.abcam.com/pdf/chromatin/epigenetic-modifications.pdf

lysin – acetylace, metylace (mono, di, tri), monoubiquitinace, ADP ribosylace arginin – metylace (mono, di, tri), deiminace (citrulin) serin, threonin, tyrosin serin prolin - palmitoylace - isomerizace – fosforylace http://docs.abcam.com/pdf/chromatin/histone_marks.pdf

Kdo modifikuje histony?

Histon modifikující enzymy jsou přinášeny transkripčními faktory nebo rozeznávájí už existující modifikace acetylázy deacetylázy methylázy demethylázy kinázy ubiquitin ligázy isomerázy

Acetylace histonů rozvolňuje chromatin

histon deacetylázy (HDAC) například HDAC1,2,3, Sir2 histon acetyl transferázy (HAT), například p300, CBP Chromatin kompaktovaný, méně přístupný, histonové konce se vážou na sousedící histon.

Acetylová skupina přidá negativní náboj na histonový konec, ten se odpoutá od sousedního histonu a tím rozvolní okolní chromatin

Trends in Pharmacological Sciences Volume 31, Issue 12 2010 605 - 617

Specifické modifikace histonů jsou rozeznávány proteiny se specifickými

histon vazebnými doménami Histonový kód

http://docs.abcam.com/pdf/chromatin/histone_marks.pdf

a další…

Způsoby vazby proteinů na modifikované histony

Histonový kód je čtený histon vazebnými proteiny

aktivační modifikace H3, H4 acetylace H3K4tri-metylace represní modifikace H3K9 tri-metylace H3K27 tri-metylace H4K20 tri-metylace bivalentní domény H3K4tri-metylace + H3K27tri-metylace

Post-translační modifikace histonů slouží jako signály k regulaci struktury chromatinu a přístupnosti DNA

Aktivační acetylace a metylace (H3K4/ K36/ K79) histon acetyltransferázy (HAT) Represivní metylace (H3K9/ K27) histon deacetylázy (HDAC) Transkripčně aktivní ‘ euchromatin ’ Transkripčně utlumený ‘ hetrochromatin ’ Specifiké modifiace slouží jako značka pro vazbu dalších proteinů, které remodelují histony a strukturu celého chormatinu, což má vliv na přístupnost DNA pro transkripci a další děje. Tento ‘ kód ’ se dědí i po dělení buňky a informace o kontrole exprese jsou tedy předávány ‘ epigeneticky ’

Epigenetické mechanizmy = software

EPIGENETIKA

= změny genové exprese zachované i po dělení buňky, které ale nejsou primárně kódovány sekvencí DNA • posttranslační modifikace • remodelace chromatinu • imprinting • inaktivace X-chromosomu DNA = hardware

Šíření změn chromatinu podél chromozomu pomocí ‘čtečky’ a ‘zapisovačky’ kódu

Bivalentní domény v embryonálních kmenových buňkách

Aktivační (K4trimetylace) i represní (K27trimetylace) modifikace na stejném chromozomu, s polymerázou připravenou k transkripci (poised polymerase). U důležitých vývojových genů, které je třeba rychle zapnout.

Christophersen N S , and Helin K J Exp Med 2010;207:2287-2295

Kdy dochází k modifikacím chromatinu?

1. během aktivace genů a transkripce 2. při umlčení genů 3. při imprintingu 4. při inaktivaci X chromozomu 5. při opravě DNA 6. při rekombinaci 7. při replikaci DNA

Chromatinové modifikace během transkripčního cyklu

Vazba aktivátorů na jejich rozpoznávací sekvence v enhancerech genů určených pro aktivaci Aktivátory rekrutují ko-aktivátory jako je mediátorový komplex, acetyltransferázový komplex (např.SAGA), který histony acetyluje okolo počátku transkripce. Také chromatin remodelující komplex (např.SWI/SNF), který posune nebo vytěsní histony kolem .

počátku transkripce.

Rekrutování bazálních TF a polymerázy, sestavení iniciačního komplexu TFIIH fosforyluje Ser5 v CTD doméně PolII.

Helikáza rozvine 11-15 bazí DNA sloužící jako templát pro polymerázu.

Monoubiquitinace H2B (Bre1) a následná H3K4 trimetylace histonů okolo místa počátku transkripce (Set1).

Uvolnění polymerázy a elongace.

NELF a DSIF se vážou na polymerázu některých genů krátce po začátku elongace (promoter proximal pause site), pauzující polymeráza (paused polymerase).

Fosforylace Ser2 v CTD, DSIF a NELF díky P-TEF2 (positive transcription elongation factor 2)

CTD doména váže během elongace proteiny modifikující chromatin, například SETD2 trimetylující H3K36 a acetylázy. Histony před polymerázou musejí být odstraněny a za polymerázou opět navázány do nuklesomů –díky chromatin remodelujícím komplexům a histonovým chaperonům (např. FACT komplex) Specifické modifikace chromatinu ve specifických místech genu zajišťují, aby transkripce začala na definovaném místě promotoru (a ne třeba uvnitř genu). Modifikace také ovlivňují (alternativní) splicing.

http://docs.abcam.com/pdf/chromatin/Chromatin-remodelling-and-the-transcription-cycle.pdf

nukleosomy s H2A.Z variantami oblast bez nukleosomů nukleosomy s H3.3 variantami M. Smolle, J.L. Workman / Biochimica et Biophysica Acta 1829 (2013) 84–97

Histonové varianty

Role při transkripčních regulacích, ale i při segregaci chromozomů, opravách DNA, kompaktaci DNA ve spermiích…

Histonové varianty

Role při transkripčních regulacích, ale i při segregaci chromozomů, opravách DNA, kompaktaci DNA ve spermiích…

H2A.Z

- v nukleosomech obklopujících počátek transkripce většiny genů (-1 a +1 nukleosom) a enhancery - +1 nukleosom je přesně umístěné vzhledem k počátku transkripce, díky chromatin remodelujícím enzymům stabilní asociace H2A.Z s DNA, pomáhají udržet ‘nukleosome free region’ v místě nasedání polymerázy - neváže histon H1 - acetylovaný pozitivně ovlivňuje transkripci, usnadňuje nasedání polymerázy - H2A.Z bez acetylace, nebo monoubiquitinovaný, je složkou heterochromatinu - někdy jako heterodimer H2A-H2B/H2A.Z-H2B na stejném nukleosomu

H2A.Z nukleozomy jsou aktivně umisťovány POUZE kolem počátku transkripce

H2A.X

– serinové zbytky na C-konci, které mohou být fosforylovány = g H2A.X

- fosforylace jako odpověď na dvojvláknové zlomy reparačních a remodelačních enzymů v DNA, pomáhá vazbě - remodeling a inaktivace sex chromozomů

CenH3

– specifická varianta na centromerách , k sestavení kinetochoru - druhově se liší (CENP-A lidská forma cenH3) CENP-A nukleozom

H2A.X

– serinové zbytky na C-konci, které mohou být fosforylovány = g H2A.X

- fosforylace jako odpověď na dvojvláknové zlomy reparačních a remodelačních enzymů v DNA, pomáhá vazbě - remodeling a inaktivace sex chromozomů

CenH3

– specifická varianta na centromerách , k sestavení kinetochoru - druhově se liší (CENP-A lidská forma cenH3)

H3.3

- složkou aktivně transkribovaných genů , enhancerů a promotorů, kde jsou histony aktivně odstraňovány a opět inkorporovány

MacroH2A

– nehistonová ‘makrodoména’na C-konci - makrodoména může být poly-ADP-ribosylována pomocí PARP1 enyzmu (poly-ADP-rinosyl transferáza), snižuje transkripci a vede k represi genů

H2A.Bbd

– ‘H2A Barr body deficient’ (chybí na inaktivním X-chromozomu) - chybí C-konec postranslačně modifikovaný u klasického H2A - v transkripčně aktivních genech hlavně v mozku a varlatech Histonové varianty jsou přidávané na DNA až po replikaci inkorporovány normální H3.

DNA, během replikace jsou vždy

Protaminy

- analogy histonů ve spermiích, spolu s histonovými variantami specifickými pouze pro spermie nahrazují většinu normálních nukleosomů a kompaktují genom. Je důležité vymazat epigenetické modifikace otce před oplozením vajíčka.

Většina eukryot má pouze jednu formu H4 a H2B (trypanozoma dvě formy od každého histonu)

ATP dependentní chromatin remodelující komplexy

Nukleosomy mohou bránit přístupu TF a tím bránit transkripci.

‘ Pionýrské’ transkripční faktory mohou vázat DNA i na nukleosomech a pomocí chromatin remodelujícíh komplexů odstranit nebo posunout histony kolem počátku transkripce a umožnit tak sestavení iniciačního komplexu.

Mechanismus remodelace chromatinu

1. nucleosome sliding

1.

(remodelling) 2.

3.

4.

Vzájemně se nevylučující mechanismy.

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression Volume 1681, Issues 2–3 2005 59 - 73

Nukleozomy existují v dynamické rovnováze, chromatin remodelující enzymy pouze posunují rovnováhu určitým směrem

Chromatin remodelující komplexy

4 rodiny:

SWI/SNF, ISWI, Mi-2, INO80

Pořadí nasedání TF, HAT a remodelujících komplexů se liší od typu promotoru

Nejčastější scénář: 1. Transkripční faktor váže DNA 2. Histon acetyl transferáza (HAT) se váže na TF 3. HAT acetyluje okolní histony a rozvolní chromatin 4. Chromatin remodelující komplexy se vážou na TF nebo přímo na histony a přesouvají je, aby zpřístupnily DNA 5. Vážou se další transkripční faktory 6. Vazba polymerázy 7. K iniciace je potřeba pozitivní signál od specifických transkripčních faktorů přes mediátorový komplex

UMLČOVÁNÍ TRANSKRIPCE (gene silencing)

Cílené zastavení transkripce specifických úseků DNA: HP1 and Polycomb silencing BLACK chromatin specifické histonové modifikace vedoucí ke kompaktaci chromatinu a jeho znepřístupnění pro TF a polymerázu Polycomb a HP1 fakultativní heterochromatin role

DNA modifikujících proteinů

+

metylace DNA

BLACK chromatin

– zatím prokázán jen v Drosophile, asociovaný s jadernou laminou, 48% genomu, bez HP1 a Polycomb, hodně H1, umlčené geny aktivní během vývoje organizmu Nature review genetics (12) 2011

Vznik a šíření fakultativního heterochromatinu přes HP1 protein

Iniciace heterochromatinu vazbou (KRAB-ZFP ) Kruppel associated box domain zinc finger proteins Velká rodina transkripčních faktorů (asi 350 u člověka), vážou nas sebe

KAP1

(KRAB associated protein1), který je místem k navázání heterochromatin proteinu 1 (

HP1

) a H3K9 trimetyláz (H3K9 trimetyláza) KAP1 KRAB histon 3 K9 trimetylace Šíření heterochromatinu oběma směry!

Šíření heterochromatinu přes Polycomb group proteiny

PRE

– polycomb response element na DNA, váže PRC1, PRC2 nebo PhoRC komplexy 1. Specifické transkripční faktory nebo ncRNA rekrutují PRC2 komplex H3 K27 trimetylace 2. sám PRC2 se váže na H3K27 tri, (šíření heterochromatinu) 3. H3 K27 trimetylace umožní vazbu PRC1 komplexu a ubiquitinace H2A K119 Sauvageau M, Sauvageau G: Polycomb group genes: Keeping stem cell activity in balance. PLoS Biol 6(4): e113, 2008

4. Deacetylace histonů (H3 a H4) 5. metylace DNA Kompaktace chromatinu, brání přístupu dalších chromatin modifikujících proteinů a polymerázy. Sauvageau M, Sauvageau G: Polycomb group genes: Keeping stem cell activity in balance. PLoS Biol 6(4): e113, 2008

Poziční efekt

(position effect variegation) Šíření heterochromatinu z centromerických nebo telomerických oblastí nebo v blízkosti inaktivovaných transpozonů Bez specifických inzulátorů by se chromatin šířil dále po chromozomu.

Polycomb komplexy řídí expresi mnoha vývojových genů

Například Hox genů (homeotických genů) Geny řídící identititu jednotlivých segmentů embrya podél anterio posteriální osy Transkripční faktory s homeobox doménou (vazba DNA), řídí expresi genů pro vývoj hlavy, oka, křídel atd.

Genové klastry, kde pořadí na chromozomu odpovídá pořadí exprese v embryu = kolineární exprese Drosophila dva klastry ne stejném chromozomu, vyšší organizmy několik klusterů na různých chromozomech

Objevené na Drosophile jakožto ‘

homeotické

’ mutace, tedy mutace transformující jednu část těla v jinou (= ‘Antennapedia’ and ‘bithorax’) wild type Antp bx

Exprese homeotických genů působí jako trvalé označení polohy dané buňky podél anterio-posteriální osy

Ačkoliv exprese homeotických genů probíhá v rané embryogenezi, označí polohu buňky a předurčí ji k vývoji určitým směrem (t.j. k vývoji určitého orgánu) mnohem později během embryonílního vývoje Jak si buňka tuto informaci pamatuje?

Remodelace chromatinu Polycomb group proteiny X Trithorax group proteiny Posttranslační histonové modifikace

Metylace DNA

  u prokaryot metylace označuje nově vzniklé DNA vlákno během replikace u eukaryot metylace slouží k umlčení genové exprese

Metylace cytosinů

cytosin 10% genomu u živočichů, 30% genomu rostlin 5-metyl-cytosin

Metylázy a demetylázy

krátká rotpoznávací sekvence pro metylázy CG u živočichů, CNG u rostlin

de novo metylázy demetylázy udržovací metylázy

(pro zachování metylačních značek během replikace) DNA metylace je stabilní během buněčného dělení.

Umlčování genové exprese je často spojeno s metylací DNA

Dva mechanizmy bránící expresi genů:  CH3 skupiny míří do velkého žlábku a brání nasedání transkripčních faktorů 

MeCP

– methyl cytosine binding protein váže se na CH3 skupiny a přináší s sebou deacetylázy kompaktace DNA

CpG ostrovy

(CpG islands, CG islands) • • • • • oblasti s velkou hustotou CG sekvencí asi 40% promotorů leží v blízkosti CpG ostrovů aktivní geny mají CpG sekvence nemetylované (houskeeping geny) CpG ostrovy neaktivních genů jsou metylované tkáňově specifické geny mají sekvence metylované ve tkáních, kde nejsou exprimované, ale nemetylované ve tkáních, kde jsou exprimované nemetylovaná DNA metylovaná DNA

Metylační profil většiny genů je vymazán krátce po oplození vajíčka

Mechanismus de novo metylace není dobře znám… Několik genů nemá metylační značky vymazány - imprinting

Imprinting

Metylační značky uniknou vymazání a reprogramovaní během embryogeneze  Igf2 gen zděděný od matky je v somatických buňkách vždy metylovaný (neaktivní)  Igf2 gen od otce je vždy nemetylovaný (aktivní) Pouze při formaci dalších vajíček budou obě alely Igf2 znovu metylované a ve spermiích obě demetylované.

Inaktivace X-chromozomu

kočka Calico Gen pro barvu srsti leží na X-chromozomu Calico kočka je heterozygotní pro tento gen (druhá alela je mutantní, neprodukuje barvivo) Náhodná inaktivace X-chromozomů Oblasti s bílou srstí mají inaktivovaný X chromozom s normální alelou a aktivní pouze X chromozom s mutantní alelou Samec vždy normální hnědý U savců, hub a rostlin

Xist gen

(X-inactive specific transcript) • • • • leží na X chromozomu nekóduje protein, ale pouze RNA metylovaný a tedy neaktivní na aktivním X chromozomu nemetylovaný a tedy aktivní na neaktivním X chromozomu přenesení Xist genu na jiný chromozom stačí k téměř úplné deaktivaci tohoto chromozomu metylovaný Xist gen aktivní Xist gen aktivní X chromozom neaktivní X chromozom

1.

aktivní X 2.

neaktivní X • Oba Xist geny se mírně exprimují, stejně jako jejich antisense transkript Tsix Tsix RNA • Na aktivním X se začně více exprimovat Tsix, který utlumí expresi Xist = aktivní Tsix Tsix RNA • Na neaktivním X se začně více exprimovat Xist a utlumí se Tsix = aktivní Xist

aktivní X 3.

neaktivní X Neaktivní X: Xist RNA postupně směrem od Xist genu pokryje chromozom, na kterém se nachází, váže PRC2 komplex, deacetylázy a další chromatin modifikující a DNA metylující proteiny K27 trimetylace, deacetylace H4, macro H2A histonová varianta inaktivace téměř veškeré transkripce stabilní po zbytek života buňky 4.

Aktivní X : pouze Xist gen je metylovaný a tedy neaktivní, ostatní geny funkční Každá žena je genetická mozaika!

Ani jednovaječná dvojčata nemusí být stejná… http://www.youtube.com/watch?feature=player_embedded&v=n330FzHpI90

Barrovo tělísko

Heterochromatin naktivního X chromozomu viditelný pod světelným mikroskopem nebo při imunodetekci H3K27

Mapování metylovaných cytosinů v genomu

Bisulfidické sekvenování Imunoprecipitace pomocí protilátky proti 5-mC

Buněčný metabolismus má výrazný vliv na transkripci

Mnoho transkripčních regulátorů potřebuje metabolity pro svou funkci.

ATP O2 chromatin remodelling enzymes histon demethylases (JmJC) Trends in Biochemical Sciences November 2012, Vol. 37, No. 11

Metabolismus je klíčový regulátor mnoha buněčných dějů

normální buňka hladovějící buňka rakovinná buňka

O

2

ATP

: ADP NAD + : NADH SAM a KG

O

2 ATP :

ADP NAD +

: NADH SAM a KG O 2

ATP

: ADP NAD + :

NADH

SAM a KG úroveň metabolismu ovlivní aktivitu proteinů, které potřebují metabolity jako substráty nebo kofaktory ke své činnosti

vliv na transkripci, ale i buněčnou signalizaci, replikaci atd.

Mnoho proteinů působí mimo jiné jako metabolické sensory

regulace exprese metabolických genů metabolism transkripce signální dráhy replikace buněčný metabolismus ATP, NAD, acetylCoA, SAM, O2… metabolické senzory (HAT, Sir2, SWI/SNF….)

Krejci lab Raquel Perez-Gomez Zorana Vujin Pavel Steffal Matej Horvath Vera Slaninova

Laboratoř vývojové biologie a genetiky

Vladka Tuckova