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三重四极杆液质联用仪基础知识 和食品安全中的应用 液相色谱质谱联用 2 内容 3 • 第一部分 LCMSMS质谱基础知识 • 第二部分 使用和维护 • 第三部分 应用实例 第一部分 质 谱 基 础 质谱仪的组成部分 真空系统（分子涡轮泵和机械泵） 大气压 进样系统 电喷雾离子化 ESI 大气压化学离子化APCI 大气压光离子化 APPI 5 离子化 质量 方式 分析器 Quadropole Ion Trap TOF Magnetic FT-ICR Obitrap 数据处理 系统 检测器 打拿级 电子倍增器 离子化接口 • 液质联用的主要困难 HPLC 6 MS 高压液相操作 要求高真空 液体进入离子源转变为大量气体 只允许有限的气体进入离子传输系统 常常使用无机盐缓冲盐 需采用挥发性缓冲盐 分子状态 离子状态 离子源（API大气压电离技术） 离子源作用： 1. 2. 3. 4. 将导入质谱仪系统的样品去溶剂化 将离子源处的大气压与质谱仪系统一级真空阻隔开 被分析物离子化或将溶剂中的离子转化成气相 去除中性物质和带反极性电荷离子，否则会对分析 产生干扰 离子源类型： 1. 2. 3. 7 电喷雾电离（ESI） 大气压化学电离（APCI） 大气压光电电离（APPI） 离子化方式 API（大气压离子化） API CI EI Soft 软电离 无或很少碎片信息 8 离子化方式 硬电离 碎片信息 电喷雾电离(ESI)基本原理 Ray Limit＝10cm2/V 离子传输毛细管 ESI 针 溶剂挥发离子脱溶剂化 +/- 3kV 大气压 液滴 小液滴 离子 喷雾口 离子簇和不同离子族 9 第一步：离子的产生 待测物质在溶液中的状态（溶液化学） B+RCOOH BH++RCOO- 有机碱 HA+NH3 有机酸 10 A-+NH4 第二步：雾化 11 第三步：去溶剂化 12 第四步: 离子从溶剂的解吸附（气相离子的产生） 电荷密度 10(8) V/cm ~为了把 ESI 灵敏度最大化，使用挥发性的缓冲液，不形成离子对。 13 ESI 喷嘴横截面 Auxiliary Gas－辅助气 ±5kV 喷嘴 喷针 Sheath Gas－鞘气 14 喷雾束 ESI 15 大气压化学电离 (APCI) • • 通过电晕放电离子化 大气压化学电离有三个过程 1. 在放电电极电晕放电作用下，氮气载气和气化的液相色谱溶剂发生反应，产生预反应离子。 O2 + e- → O2+. + 2eN2 + e- → N2+. + 2e- 2. 通过一系列复杂反应，预反应离子与溶剂分子反应形成溶剂离子 H3O+和CH3OH+ 3. 溶剂离子与被分析物分子反应，在正电离模式下，形成正的分子离子；在负的电离模式下， 形成负的分子离子 H3O+ + Analyte → (Analyte + H)+ + H2O OH- + Analyte → (Analyte – H)- + H2O 16 大气压化学电离 (APCI) 鞘气通气管 样品导入针 分析物M和溶剂挥发 进入质量分析器 喷雾气体 溶剂化加热锁 碰撞区 电晕针放电区 电晕放电区放大图 © 2004 Dr. Paul Gates, University of Bristol 电晕放电针高压 17 APCI 探针 离子传输毛细管 APCI探针 电晕针 离子传输毛细管 离子源接口 18 大气压光电离 (APPI) • • • 通过APCI探头去溶剂化、气化 借助紫外光灯源离子化 电离过程分两步 ： 1. 被分析物质与紫外光源发生相互作用（氪灯发射10.0到10.6电子伏特的光子）。如果被分 析物质的电离势能（IP）小于光子能量，那么被分析物质被电离成分子离子 M + hv → M+ + e2. 如果在质子溶剂介质中，分子离子会接受质子而形成[M+H]+离子 M+ + S → [M+H]+ + [S-H] 19 PAHs 20 APPI 质谱图 离子源选择 (需要考虑的化学因素) ESI (H-ESI): 离子在液态中形成 (Ions formed by solution chemistry?) 对热不稳定化合物首选 (Good for thermally labile analytes) 对极性或半极性化合物首选 (Good for polar / semi-polar analytes) 可形成多电荷离子分析蛋白质、多肽等大分子物质 （Good for large molecules (proteins / peptides) APCI/APPI: 21 离子从气态中形成（Ions formed by gas phase chemistry） 对易挥发、热稳定的化合物首选（Good for volatile / thermally stable） 对弱极性或半极性化合物首选 （Good for non-polar / semi-polar） 只可形成单电荷离子，可分析小分子化合物 （Good for small molecules (steroids) APPI对化学结构中有共轭双键的化合物分析有利 （Good for ions containing a chromophore (APPI) 大气压下离子化适用范围 分子量 105 ESI -2 (multi ion generation) 104 103 APPI Non polar 22 APCI ( low middle polar) Middle polar ESI -1 (high polar) High polar 质量分析器类型 • 四级杆质量分析器 (Quadrupole Mass Analyser) • 离子阱质量分析器(Ion Trap Mass Analyser, IT) • 飞行时间质量分析器(Time Of Flight Mass Analyser, TOF) • 傅立叶变换离子回旋共振质量分析器(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance，FT-ICR) • 静电场轨道阱质量分析器（Orbitrap） 23 四极杆分析器 非谐振离子 谐振离子 qz = -qz = 2eV mr2w2 +/(U+Vocoswt ) 离子束 4eU mr2w2 -/+(U+Vocoswt) 24 az = -az = 四级杆稳定区域 APEX (0.706, 0.23699) YZ-stable XZ-stable Mathieu 方程 25 Full Scan -不同质量离子的稳定区间 RF,DC Scan Line 900 a DC constant q RF 800 700 Sample3_03 #1408 RT: 14.70 AV: 1 NL: 3.33E7 F: + c Full ms [ 30.00-1000.00] 69 100 600 95 80 500 95 75 90 85 Relative Abundance DC Sample3_03 #1408 RT: 14.70 AV: 1 NL: 3.33E7 90 F: + c Full ms [ 30.00-1000.00] 85 69 100 252 60 55 70 50 65 4583 60 40 55 50 300 83 65 75 Relative Abundance 400 70 80 350 338 55 252 350 35 386 30 55 25 338 239 145 45 206 125188 368 20 109 175 95 40 15 35 200 368 188 175 219 10 30 5 25 0 125 20 15 265 386 145 387 295 239 206 100 200 300 400 109 95 219 10 500 m/z 600 700 900 1000 265 387 5 295 0 100 100 200 300 400 500 m/z 600 700 0 0 1000 2000 m/z 100 26 800 3000 4000 RF m/z 500 5000 6000 m/z 1000 7000 800 900 1000 四极杆扫描模式 SCAN模式 假设周期0.1s，则扫描速率为 5000 amu/s SIM模式 同时检测3个离子。假设周期 0.3s，则花在每个离子上的时 间分别是0.1s。 27 四级杆质量分析器 (Quadrupole Mass Analyser) 四极质谱结构简单，价廉，体积 小，易操作，无磁滞现象，扫描 速度快，灵敏度高，适合于GCMS, LC-MS。分辩率不高。 理想的四极场为双曲线型，但加工的困难，往往用四根杆代替。 Thermo获得专利的HyperQuad™技术，实现真正的双曲线静电场 28 串联质谱 （QQQ） 29 Lecture 2.1 29 TSQ三重四极杆的仪器结构 检测系统 • Ion Max离子源 • • • • • HESI-II/APCI 吹扫挡锥 可加热的金属离子传输管 T-lens和Skimmer（Quantum系列） S-lens（Vantage) 离子透镜 • 离子透镜组件 • Q0和Q00 • 质量分析器 • Q1和Q3四极杆 • Q2碰撞池 • 检测系统 • 打拿极 • 电子倍增器 30 离子源 质量分析器 信噪比改善，更丰富的结构信息 Intensity 我们为什么做串联质谱 信号 噪声 信造比 分析的级数 31 TSQ三重四极杆质谱的扫描模式 32 扫描模式 Q1 Q2 Q3 目的 全扫描 扫描 全部通过 全部通过 分子量信息 选择离子扫描 固定质荷比 m/z 全部通过 全部通过 定量 子离子扫描 固定质荷比 m/z 全部通过(+ CE) 扫描 结构信息 选择反应监测扫描 固定质荷比 m/z 全部通过(+ CE) 固定质荷比 m/z 目标定量 中性丢失 扫描 全部通过 (+ CE) 扫描 分析物筛选监测 母离子扫描 扫描 全部通过 (+ CE) 固定质荷比 m/z 分析物筛选监测 全扫描(Scan) Q1全扫描模式—— Q1扫描 33 Q3仅用射频 仅用射频 选择离子扫描(SIM) 目的: 对特定离子进行扫描（定量） Q1设定 34 仅用射频 Q3仅用射频 选择反应监测 （SRM) 目的：对子离子进行定量扫描 Q2 Q1 Set RF Only + Ar Q1 Q3 Transition 35 Q3 Set 二级子离子全扫描 目的：对特定母离子的碎片离子进行全扫描 设定Q1 36 Q3扫描 射频和氩气 母离子扫描 (PS) 目的：检测产生特定碎片离子的母离子 Q1扫描 37 射频＋氩气 设定Q3 中性丢失扫描（二级质谱扫描） 目的：化合物种类识别，例如磷酸化类化合物 Q1扫描 38 射频＋氩气 Q3扫描 TSQ三重四极杆质谱的特点及应用领域 特异 性强 食品安全 适用范围 复杂且干扰严重的体系 环境监测 多组分分析 痕量样品分析 灵敏 度高 39 临床法医 毒物分析 以定量为主 药物研发 转换打拿极 正离子（或负离子）被推向转换 打拿极。 因此, 会抛射出成比例 的反电荷的离子束，包括电子。 转换打拿极固定工作电压 - 15 kV (正离子模式) +15 kV (负离子模式) 40 电子倍增器 二级粒子进 入倍增管 每个电子打到倍增管表面时会投 射出更多电子 该过程的层叠效应会在正极产生 电荷 阴极 电荷代表离子产生的信号 加高电压 阳极杯 ~ 41 数据系统的信号 第二部分 使用和维护 色谱柱和流速的选择 常规色谱柱 流速 柱内径 1.0 mL/min 4.6 mm 0.5 mL/min 3.0 mm 0.2 mL/min 2.1 mm mL/min 1.0 mm 50 微流和纳流色谱柱 长度 流速 作用 EASY-Column, 2cm, ID100µm, 5µm 3μL/min 捕集柱 EASY-Column, 10cm, ID75µm, 3µm 300nL/min 分析柱 43 内径 粒径 流动相添加剂 酸性物质 不推荐使用无机酸（会导致源腐蚀） 推荐使用甲酸和乙酸 碱性物质 不推荐使用金属碱性化合物（会导致源腐蚀） 推荐使用铵及氨水。 表面活性剂 洗涤剂和其他表面活性剂会抑制离子化 三氟乙酸 (TFA) 可以提高色谱分辨率，但无论是正离子化还是负离子化模式，都会 抑制离子化 三乙胺/三甲胺 (TEA/TMA) 44 在负离子化模式下，可以加强去质子化作用。 Buffers 缓冲液 当使用非挥发缓冲液，应该使用吹扫挡锥 如果可能，尽量避免使用非挥发液相色谱添加物质，例如： 碱金属磷酸盐 硼酸盐 柠檬酸盐 如果使用缓冲盐，应该经常清洗离子传输管和Q00。 45 液质联用添加剂与缓冲液总结 Acetic Acid (0.1 %, v/v) Formic Acid (0.1 %, v/v) Ammonium Hydroxide 供质子体 质子受体 Ammonia Solutions Trichloroacetic Acid (< 0.02 % v/v) Trifluoroacetic Acid (< 0.02 % v/v) Triethylamine (< 0.02 % v/v) 改善色谱分离 离子对试剂 Trimethlyamine (< 0.02 % v/v) Ammonium Acetate (<10 mM) Ammonium Formate(<10 mM) 46 缓冲溶液 常用液质流动相 47 反相RP-HPLC Methanol 甲醇 Acetonitrile乙腈 Water水 Isopropanol异丙醇 正相NP-HPLC Dichloromethane二氯甲烷 Chloroform氯仿 Hexane正己烷 气体和溶剂纯度 氮气: High purity (>99%) 氮气 气体压力：690 ±140 kPa (100 ±20 psi), 0.4~0.6 MPa 氩气: Ultra-high purity (>99.995%)，氩气超高纯(>99.995%) 气体压力：135 ±70 kPa (20 ±10 psi), <0.15 Mpa Solvent/Reagent溶剂/试剂 48 Specification说明 Methanol甲醇 HPLC grade Acetonitrile乙腈 HPLC grade Water水 HPLC grade Isopropyl alcohol异丙醇 HPLC grade Ammonium acetate乙酸铵 A.C.S. reagent Acetic acid (modifier)醋酸 A.C.S. reagent Divert Valve切换阀 使用切换阀可以增加API源的耐用性 我们通常在运行分析前将转换阀打开，将流动相转入废液，在分析 物质出峰之前提前再转换到分析状态，以便保护检测器 转向阀 样品环 接入废液罐 堵头（可 选择） 接入废液 从液相色 谱泵接入 从注射泵 接入 从液相色谱泵接 入 进入离子源 49 进入离子 源 Xcalibur中Divert Valve 切换阀设置 50 推荐维护日程 每日维护-使用前检查 1. 检查氩气和氮气压力 氮气 : 纯度 (＞99 %) 压力Gas pressure: 690± 140 kPa (100 ±20 psi), 0.4~0.6 MPa 氩气 : 超高纯Ultra-high purity (>99.995 %) 压力Gas pressure: 135 ±70 kPa (20 ±10 psi), <0.15 Mpa 51 2. 检查离子规压力，确认真空系统处于可操作状态，小于6×10-6 Torr 3. 移走离子传输毛细管入口上的保护垫或放电针，重新检查前级泵(1.0 ~ 2.0 Torr)，和离子规压力，确认真空系统在可操作条件。 4. 检查温度(≤46℃)和湿度(40 ~60 %)； 5. 检查数据系统的磁盘空间 推荐维护日程 每日维护-使用后维护 52 1. 冲洗样品管路和大气压电离探针（电喷雾和大气压化学电离）； 2. 设定系统在待机状态； 3. 清洗离子吹扫锥和离子传输毛细管； 4. 设定离子传输毛细管温度200 ℃ ; 5. 使用真空隔离垫或者放电针堵上离子传输毛细管口; 6. 废液瓶废液倒掉; 推荐维护日程 每日维护-使用后维护 如何冲洗样品传输管路等？ （ESI模式下） 按以下步骤设定ESI 参数 53 1) 设定喷雾电压为0 2) 设定鞘气流速为30 3) 设定辅助气流速为5 4) 设定流动相为水和甲醇50：50，开启液相泵使流动相进入大气压电离源 5) 使流动相流过样品传输管路，以及大气压电离源15分钟 6) 15分钟后，关闭液相的流动相，保持五分钟 7) 5分钟之后，将质谱仪打到待机状态 推荐维护日程 每日维护-使用后维护 如何清洗样品传输管线？（APCI模式下） 按以下步骤设定APCI 参数： 54 1) 设定大气压化学电离源放电电流为0 2) 设定鞘气流速为30 3) 设定辅助气流速5 4) 设定大气压化学电离汽化温度为500 ℃ 5) 设定液相流动相为水与甲醇50：50溶液，以500 µl/min 的流速流入离子源 6) 使流动相流入样品传输管路，大气压电离探针15分钟 7) 15分钟后，关闭流动相，保持五分钟 8) 5分钟后，将质谱仪处于待机状态 推荐维护日程 每周维护： 55 1) 检查机械泵泵油水平线； 2) 如果必要，添加泵油 ； 3) 打开机械泵的排气阀 ，约半个小时； 4) 半个小时候，关闭排气阀； 推荐维护日程 每月维护： 检查氩气罐压力，如果必要更换气瓶 1) 检查TSQ是否需要校正 2) 检查空气过滤器，如果必要应该清洗。 3) 如果泵每天运转24小时，每月有一天要检查： 每三/六个月 - 更换机械泵油。 56 附 仪器状态指示器 在质谱仪前面板上的右上角装置有6个指示灯 灯黄色：涡轮分子泵转速在750 Hz，可以安全 打开离子规。 黄灯：建立一个通信连接 绿灯：质谱和数据系统通信连接 灯绿色：在分析器腔室内的压力在或低于 8×10-6 Torr 绿色：供给真空系统和电子组件 的电压 Power Vacuum System Communication Syringe Pump Scan 绿色注射泵启动 黄色：MS待机状态 绿色：仪器开机 57 闪烁兰光：质谱开机 运行并扫描 黄色泵达到行程尾端 附 仪器状态指示器 在转换/进样阀上的前面板安装另外两个指示灯 指示灯 Load Inject 进样位置指示 Detector Waste 切换位置标签 手动按钮 转换/进样阀按钮和发光指示灯 58 附 Power Panel电源板 主电源开关 电子服务器开关 真空系统开关 重启按钮 机械泵 放空阀 以太网 总电源输入 59 前级泵电源 第三部分 应用实例 TSQ三重四级杆质谱仪 检测器 Q3 双曲面四极杆 Q0 离子源 61 Q1 双曲面四极杆 90度弯曲的 Q2碰撞室 食品和饲料中霉菌毒素的检测 62 LC&MS条件 63 SRM 64 H-ESI 65 H-ESI 66 H-SRM 67 校准曲线 0.1-1000ppb 68 黄曲霉毒素B1 69 谢 谢 Enabling customers to make the world healthier cleaner safer 88