Transcript Praktika 1 web - Ústav histologie a embryologie

Úvod do studia cytologie a histologie
Základní pojmy. Metody studia buněk a
tkání. Histologický preparát. Odběr, fixace,
značení a zpracování vzorků. Základy
mikroskopování.
Ústav histologie a embryologie
MUDr. Blanka Zajícová
Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241
• Histologické vyšetření:
– součást klinických vyšetřovacích metod
– umožňuje stanovit diagnózu, rozpoznání nemoci je
předpokladem správné léčby pacienta
– metoda vědecké práce
• Histologická technika
– soubor postupů, metod a přístupů, které vedou
ke zhotovení preparátu
Preparát:
•
•
•
•
tenký řez tkáně (pro světelnou mikroskopii 6-8µm)
zpracován histologickou metodou
zamontován pod krycí sklo
připraven ke studiu pod světelným mikroskopem
Odběr materiálu
Způsoby odběru:
1. Nekropsie – z mrtvého organismu, max. 12-24 h po smrti
2. Biopsie – ze živého organismu (peroperační biopsie)
Odběr musí být rychlý, šetrný a bezpečný pro pacienta.
Excize – vyříznutí skalpelem, žiletkou, nesmí se příliš
poškodit tkáň
Punkce – širší jehla se stříkačkou, např. kostní dřeň, játra,
ledviny
Mikroabraze – kyreta, vyšetření endometria
Stěr, nátěr – tamponem nebo štětečkem se oloupou buňky,
např. poševní cytologie
Endoskopický odběr, laparoskopie
Odebrané vzorky musí být okamžitě fixovány, označeny.
Průvodní list k zásilce histologického materiálu.
Odběr materiálu
Smrt – přerušení koordinační a obranné činnosti organismu, zásobení živinami
a kyslíkem, odvodu metabolitů
Autolýza – samovolný rozklad tkáně způsobený nekoordinovanou činností
vlastních endogenních enzymatických systémů
Hniloba – rozklad tkáně vnějšími činiteli (exogenní enzymy např. z bakterií,
plísní)
Autolýza i hniloba porušují strukturu a barvitelnost vzorku, takový vzorek nelze
hodnotit. Zabránit znehodnocení lze rychlou fixací vzorku.
Zásady odběru materiálu:
Odebírat čerstvý materiál
Šetrným způsobem
Řádně označit
Okamžitě fixovat
Vyplnit průvodku
Fixace
Fixace - rychlá a šetrná konzervace tkáně fixačními prostředky
1.
Fyzikální fixační prostředky: ovlivňují transportní funkci vody a tím naruší
enzymaticky katalyzované reakce v buňkách
- fixace působením nízké teploty: rychlé zmrazení, „suchý led“, zkapalněné plyny
(tekutý dusík)
- fixace vysušením tkáně za nízké teploty (freezing-drying): mrazová sublimace,
histochemie – průkaz aktivity enzymů
- fixace mikrovlnným zářením
2.
Chemické fixační prostředky
Založeny na působení par nebo roztoků účinných látek – fixačních tekutin,
které ve vhodné koncentraci vyvolávají jemnou a šetrnou denaturaci
enzymových proteinů.
3.
Fyzikálně chemické metody
- kombinace předchozích, např. chlazená fixační tekutina
Požadavky na fixaci
-
musí rychle působit v celém vzorku
musí dobře uchovat strukturu buněk a tkání
musí umožňovat další požadované zpracování, vyšetření
Z toho důvodu musí být vzorky přiměřeně velké: pro světelnou mikroskopii
max. 1cm3, spíše ploténky.
Fixační tekutiny musí být nadbytek – 20 až 50x větší objem.
Vzorek se nesmí přilepit ke dnu ani plavat neponořený.
Dostatečně velké hrdlo nádobky, řádné uzavření.
Správné označení materiálu: nalepovací štítek + označení přímo ke vzorku.
Nesmí dojít k záměně materiálu!
Žádanka na histologické vyšetření.
Fixační prostředky
Formol:
100% formol je 40% vodný roztok formaldehydu
Nejpoužívanější, dostupný, relativně levný.
Neutrální formol: neutralizovaný uhličitanem vápenatým (asi ¼ láhve), běžně
používaná koncentrace je 10%
Rychle proniká do tkáně, je šetrný, zachovává strukturu, dobře se po něm
barví. Fixujeme asi 24h, menší kousky i méně, nemůžeme přefixovat.
slaný formol (ředěný fyziologickým roztokem)
pufrovaný formol
Bakerova tekutina:
10% formol, chlorid vápenatý, voda
Vhodná pro průkaz lipidů, enzymů vázaných na membrány.
Fixační prostředky
Bromformol:
15% formol, bromid amonný
Použití u impregnačních metod, průkaz gliových buněk v nervové tkáni.
Bouinova tekutina:
25% formol, kys. pikrová, ledová kyselina octová - 5ml těsně před použitím
Po fixaci se dává do 80% etanolu. Nemůže přefixovat.
Nevýhody: nehodí se pro fixaci krevnatých orgánů, není vhodná pro průkaz
lipidů
Fixační prostředky
Fixační tekutiny se sublimátem:
SUSA:
sublimát (chlorid rtuťnatý), chlorid sodný, formol, destilovaná voda, kyselina
trichloroctová, před použitím ledová kyselina octová
Výborná pro cytologii, kosti, zuby, chrupavky.
Přenáší se rovnou do 90% etanolu, v němž se provádí jódování.
Jódování – odstranění sublimátových sraženin (vznikají při fixaci) např. v Lugolově
roztoku či jódové tinktuře.
Zenkerova tekutina:
sublimát, dvojchroman draselný, síran sodný, destilovaná voda, ledová kyselina
octová, NENÍ FORMOL!
Fixace 24h, pak vypírání bločku v tekoucí vodě (24h), pak 70% etanol a jódování.
Fixační prostředky
Etanol:
použití zejména v neurohistologii – Nisslova metoda. Tkáň se značně
dehydratuje a extrahují se tuky – zvýraznění komplexů granulárního
endoplazmatického retikula (Nisslova substance), ta se pak barví např.
thioninem.
Aceton: 0-40C, enzymová histochemie
Osmiumtetroxid:
základní prostředek fixace v technice elektronové mikroskopie. Pro světelnou
mikroskopii se nehodí – proniká pomalu do tkáně.
Zalévání
Pro běžné histologické vyšetření je potřeba odebraný a fixovaný materiál nakrájet
na řezy 4-8µm silné. Po prosycení tkáně tekutým zalévacím médiem médium
ztuhne a zvýší konzistenci (tvrdost, pevnost) vzorku, což umožní krájet tenké řezy.
1. Média rozpustná ve vodě:
celodal, želatina, metakrylátové umělé pryskyřice
Výhodná proto, že po fixaci a vyprání ve vodě můžeme přímo prosycovat,
zalévat a tvrdit.
2. Média nerozpustná ve vodě:
parafin, celoidin, umělé epoxidové pryskyřice
Zalévání do těchto médií vyžaduje nejprve důkladné odvodnění vzorku a
prosycení intermédiem (látka, která se mísí s odvodňujícím i zalévacím
médiem). Teprve pak prosycujeme zalévacím médiem.
Zalévání do parafínu
Nejpoužívanější metoda, nevhodná ale k zalévání tuhých tkání, průkazu lipidů.
Nevýhoda: smrštění tkáně při odvodnění, prosycování při vysoké teplotě
Etapy:
A/ odvodnění tkáně – dehydratace
Vzestupná řada alkoholů - etanolu (30-50-70-80-90-96-100%)
- musí být šetrné, první použitá koncentrace závisí na obsahu vody ve tkáni (např.
embryonální tkáně začínají 30%, šlacha či zub i 90%, po fixaci Bouinovou
tekutinou 80%, SUSA 90%)
- každá lázeň několik hodin, 2x se vyměňuje, celkem 1-2 dny
B/ prosycení tkáně intermédiem, projasnění
benzen, xylen, toluen, metylsalicylát, metylbenzoát
Intermédium musí rozpouštět parafín a mísit se se 100% alkoholem.
Vysoký index lomu, provádí se ve 3 lázních po 15 minutách.
C/ prosycení tekutým parafínem
parafín 560C
3 lázně parafínu při 560C, 1. lázeň asi 2-4h, 2. lázeň 4-6h, 3. lázeň 8-12h, celkem
cca 24 hodin. Teplota nesmí překročit 580C.
D/ vlastní zalití
V zalévací komůrce, používá se výhradně zkvalitněný
parafín (zahřátí na 800C, přidá se 3-5% včelího vosku a přefiltruje).
Bloček se přenese pinzetou, nahřátou preparační jehlou se zorientuje,
nechá ztuhnout. Stále u vzorku musí zůstat značení.
E/ tvrzení média
Rovnoměrné tuhnutí při pokojové teplotě, úprava bločku, přitmelení
na podložku. Pro rutinní zpracování histologických vzorků se používají
zalévací automaty.
Zalévání do celoidinu
Zalévání do želatiny
Použití: tuhé tkáně, šlachy, chrupavky,
zuby, odvápněné kosti
Výhoda: pokojová teplota
Nevýhody: trvá dlouho, nelze použít pro
lipidy, nádobky musí být dobře
uzavřené
Postup:
- odvodnění vzestupnou řadou
alkoholů
- prosycení alkoholéterem
- vzestupná řada celoidinu
(2%,4%,8%,10%)
- vlastní zalití do 10% celoidinu a
tuhnutí
- tvrzení bločku v 70-80% alkoholu
Použití: řídké struktury – placenta,
sliznice střeva, průkaz lipidů ad.
Postup:
- vyprání ve vodě
- prosycení želatinou ve
stoupajících koncentracích
(10% a 15% vodný roztok)
- vlastní zalití do 15% nebo 20%
roztoku želatiny v komůrce
- tvrzení v 10-20% formolu
Krájení na kryostatu!
Krájení řezů
Krájí řezy cca 6-10 µm
Sáňkový mikrotom: krájí parafín, celoidin, celodal
Rotační mikrotom: parafínové bloky – zhotovení sériových řezů, např.
embryologie
Zmrazovací mikrotom – krájení tkání nezalitých, zalitých do želatiny
Napínání a lepení parafínových řezů
Řezy se napínají na vodní hladině (povrchové napětí) a lepí na podložní sklo např:
•
směsí bílku a glycerinu 1:1
Nelze použít např. pro imunohistochemii, impregnaci.
Na sklíčko se rozetře bílek s glycerinem, přenese se řez a podlije destilovanou
vodou. Natažení na napínací ploténce. Označení podložního skla! Sušárna.
•
roztokem želatiny 0,5 až 1%
Řezy se podlévají želatinou, sušárna, koagulace želatiny.
Světelný mikroskop
Mechanická část: stativ, stolek, šrouby
Optická část: objektiv, okulár
Osvětlovací zařízení: světlo, kondenzor, clony
Druhy objektivů: suché, imerzní
Rozlišovací schopnost mikroskopu
– dána jeho stavbou a optickými vlastnostmi objektivu
– je vyjádřena numerickou aperturou.
NA = n*sin α
– n je index lomu media, α je polovina otvorového úhlu objektivu
Rozlišovací schopnost je minimální vzdálenost 2 bodů, které můžeme
rozlišit, mezní hodnota u světelného mikroskopu při použití šikmého
osvětlení je asi 0,2μm.
Přednášková prezentace je určena výhradně pro osobní studium studentů 1. LF UK.