Transcript 프리바이오틱스 - design
1. 서 론
돼지감자 로부터 추출한 비분해성 올리고당* , 이눌린: 프리바이오틱스, 항균성장촉진제, 항생제 대체 가능성 - 1928, 스코틀랜드, 알렉산더 플레밍, 페니실리움(penicillium) 속의 곰팡이 최초 항생 물질 “페니실린” : 인간의 세균감염 예방과 치료용 - 1950, 항생제, 가축의 성장촉진, 사료효율 개선 생산성 증대목적, 축산분야에서 사용 항생제 내성균( Super bug , bacteria) 의 출현:
‘
포도상구균’(Staphylococcus aureus) -
“
동물의 항생제는 인간항생제의 유사물, 세균은 인간항생제에 대하여 저항성을 키우는 능력이 있다” - 메티실린 내성 포도상구균(MRSA), 반코마이신 내성 포도상구균(VRSA) 0 소당류(oilgosaccharides) 2개～8개사이의 단당류 단위로써 이루어진 작은 탄수화물
0 항생제
- 동물산업 : 1940년, 클로르테트라싸이클린 (chlortetracycline, CTC) 사료 첨가 - 항생제 내성균 : 항생물질에 대한 강력한 내성을 나타내는 미생물, super bacteria / bug - 내성균의 증가 : 인체 항생물질의 오
‧
남용, 배합사료, 축산식품 잔류 - 메티실린, 반코마이신, 퀴놀렌에 대한 내성 황색포도상구균 : MRSA, VRE, QRSA,
salmonella typhimurium
DT 104 - EU : 2006년 1월부터 배합사료에 항생제 첨가 금지 - 2007.10. 국내 축산사료 항생제사용량 15배 > 호주 - 가축 항생물질 사용하지 않을 경우 : 고름우유, 브로일러/자돈 설사, 장염, 면역기능↓ - 대체소재 : 프로바이오틱스 (생균제, probiotics) 프리바이오틱스 (장내 유익균활성제, 면역증강 물질, prebiotics) 항균 생체활성 펩타이드 한방 추출물 (약용식물 추출물) 허브오일 (정유= essential oil)
–
효소활성제 유기산제... 등 계피, 피타민
0 항생제(antibiotics) - 살아있는 미생물로부터 만들어지는 항미생물 제제 - antibiotics :
‘
anti는 반대한다’,
‘
bioti는 그리스어 살아있다(bios)
’
“
살아있는 병원체에 대항하는 물질” - as 가축사료의 성장촉진제 ∵ 가축의 질병예방/치료, 영양소 이용율↑, 가축의 생산성↑ - 항생제 내성균↑, 축산물의 항생제 잔류 사회적인 문제 - 2007년 : 사료항생제(농림부 고시 제2004-72호) 53종 - 2008년 4월 감축시작 : 내성률이 높은 CTC 계열 항생제 2종+인수공용 항생제 5종 - 산란계사료 : 계란의 항생제 잔류문제로 사용이 전면 금지 25종 * 항생제의 작용기작 가) 질병을 일으킬 수 있는 유해한 미생물의 성장 및 활력을 저해 나) 동물의 성장을 억제하는 독소와 같은 미생물 관련 물질을 감소 다) 장관 내에서 필수영양소를 파괴하는 미생물의 성장 및 활력을 억제 라) 장관벽의 얇아짐으로 인한 영양소의 흡수 및 이용효율을 향상
동물약품 시장의 변화
치료용 제제 항균항생제 시장구조의 변화 치료에서 예방개념 항생제 규제 ( 정부 ) 예방용 제제 백신 대체제 사료첨가제 성장 촉진 기능
항생제와 사료첨가제의 기능
동물의약품 분류 항생제의 기능 1. 질병예방 1.
항병력 2.
항균력 2. 증체효율 1.
체중증가 2.
사료효율 증대 대체제로서의 기능 단미사료 분류
0 프리바이오틱스란: - 소장분해×, 대장 미생물발효 젖산, SCFA 생성, pH↓, 유익균주↑(비피도박테리아의 선택적 증식자극), 유해균주↓ 비피더스균의 활성효과(bifidogenic effect)를 지닌 비분해성 올리고당 - 장질환 유발 대장균, c lostridium, samonella ↓.., bifidus, 유산균의 성장을 촉진, 설사 방지, 면역능력↑, 성장촉진 - 이눌린, 프럭토올리고당, 만난올리고당, 이소말토올리고당, 글루코오리고당, 펙틴, 유충, 갈락토올리고당 - 프리바이오틱스로서 복합탄수화물인 비분해성 올리고당 가금 살모넬라의 조절 접근 가능, 생체활성 효과가 확인
bifidobacteria bifidobacterium bifidum bifidobacterium infantis
lactobacillus lactobacillus acidophilus
salmonella
staphylococcus aureus
E.coli
0 항균 프리바이오틱스란 무엇인가 - prebiotics : pre (이전의) + biotics (bioti- 살아있다, bios) - 프리바이오틱스 (prebiotics) 개념의 진화 : - 비소화성 식이성분 유익균 활성물질, 면역강화물질, 항균물질 성장촉진 by ↓ 설사, ↓ 질병 항생물질 대체재 0 prebiotics의 원 뜻 : - 사람의 위와 소장에서 분해되지 않고 대장으로 이동되어서 결장 내 미생물 특히, bifidobacteria 의 성장, 미생물의 활력 또는 미생물의 제한된 균수를 선택적으로 자극하 여서 유익한 영향을 주는 비소화성 식이성분 - 식이 내 특수한 성분을 통하여 장내 정상적으로 존재하는 프로바이오틱스와 같은 미생 물의 성장을 선택적으로 자극할 수 있는 비분해성 올리고당(nondigestible logosaccha ride, NDO) - 장관에서 숙주의 효소에 의한 소화를 자유롭게 해주며,
“
결장 내 하나 또는 제한된 수의 균의 성장과 활력을 선택적으로 도와주어서 숙주에게 유익함을 주는 비소화성 식이성 분” : NDO
0 프리바이오틱스의 분류조건 - 소화관의 상부에서 가수분해 및 흡수되지 않아야 한다 - 대장에서 유익한 미생물, 특히 비피도스균의 성장을 선택적으로 자극하고, 유해균의 성장을 강하게 억제하는 물질이어야 한다 (맹장, 결장에서 선택적 발효) - 더욱 건강한 조성으로 대장의 미생물 균총을 유지할 수 있어야 한다 숙주동물에게 유익한 장 또는 기관의 효과를 나타내야 한다 (유익한 미생물에 의해서 대사되어야 한다)
Fig. Schematic representation of the properties that allow classification of food ingredient as prebiotics.
총배설강 직장 결장 맹장 회장 췌장과 십이지장 연결 십이지장 근위 간 이자 식도 선위 췌장 공장 담낭 심장 그림 . 닭의 소화기관 소낭
0 이눌린: - 과당이 β-2,1 결합으로 연결된 선형 과당중합체 - 사람의 위액/소화효소 분해 NO, 80% 이상 대장 도달 비피더스균 활성효과 0 - 동물사료에 대한 프리바이오틱스의 첨가: 항생제를 사용하지 않고서 장 미생물 균형을 유지하는데 도움을 주고 더욱 일정하게 높은 생산성을 나타낼 수 있어야 한다. 0 프리바이오틱스로서 이눌린을 가금사료에 직접 혼합 시 문제점: - 공기 중 보관 및 유통상태에서 이눌린이 쉽게 변성될 수 있음 - 배합사료에 직접 혼합, 급여된 이눌린을 동물이 섭취할 경우, 위와 소장에서 내산성이 약하여 대장에 도달 하기 전에 분해흡수율이 높아져서 프리바이오틱스로써의 기능이 낮 아짐 0 문제의 해결: - 이눌린+항산화제(비타민 E)= 고압균질화+장용성 피복제재(소화관에서 안정된 강산성 및 대장 용해성 높은 물질) 선택=미세캡슐화-이눌로프리바이오틱스를 제조할 필요 0 - 독창성: 이와 관련한 연구결과는 보고된 것이 거의 없다.
6 5 6 1 2 1 1 2 1 2 1 2 1 1 2 그림. 이눌린의 화학적 구조 그림 . 이눌린의 입체구조 특성
2) 이눌린의 급원 - 국화과, 도라지과, 백합과 식물 근경에 콜로이드 상태의 저장 당류 (homoglycan) - 돼지감자 (Jerusalem artichokes; Helianthustuberosus) - 돼지감자 : 14~19%의 이눌린 - 양파, 파, 마늘, 바나나, 아스파라가스, 밀, 치커리, 다알리아, 금불초, 민들레
그림. 이눌린의 추출과정
그림. 이눌린 발효에 의한 SCFA 생성 비피도박테리아의 건강증진 효과
그림. 이눌린의 병원균 억제효과
0 가설: - 미세캡슐화된 이눌로프리바이오틱스가 브로일러의 맹장에서 유익한 미생물 비피도박테 리아의 증식을 통하여 유해한 미생물의 수를 낮출 수 있을 것이다 0 연구의 목표: * 가설에 대한 이론을 확립하는 것 ! - 선행연구에서 확립된 국산 돼지감자로부터 추출한 이눌린의 미생물 체외배양( in vitro ) 에 의한 비피도박테리아의 성장을 조사 - 배합사료 내 이눌로프리바이오틱스의 혼합, 급여가 브로일러의 맹장에서 비피도박테리 아의 선택적 증식( in vivo ) 효과를 규명 비피더스균 활성효과에 대한 가설을 조사
2. 재료 및 방법
0 실험 재료: - 국산돼지감자, 열수/냉각추출방법(1989, French) 평균중합도(DP: degree of polymerisation) 26, 이눌린 추출, 건조 - 비타민 E (α-tocopheryl acetate)+이눌린 고압균질기(T25 Basic, IKA, German), 고압균질물 수득 - 고압균질물+장용피복재 슈레테릭(Sureteric; Colorcon, UK) 초미세분체 피복물(고압 균질물 9: 슈레테릭 1)을 제조 - 분무건조기(B-191, Buchi, Sweiss) 건조 미세캡슐화-이눌로프리바이오틱스 제조 - 미세캡슐화-이눌로프리바이오틱스: 입자 100-200 μm, 비타민 E 0.08%, 이눌린 90%
생 돼지감자 분쇄과정 분쇄된 생 돼지감자
시료와 물 혼합 80℃ 30분 혼합
혼합 후 여과 여과 후 여액
여액 방냉(8 ℃ 저온실, 밤샘 유지) 이눌린 결정체(하층)
Fig. Pictures of inulin. Left: dried, Right(upside: cristal, bottom: powder).
0 미생물 체외배양
0 사용균주 및 배지 - 4종류 유익한 미생물: - 2종류의 혐기성 유익균 ( Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum ) - 2종류 의 호기성 유익균 ( Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei ) - 2종류 유해한 미생물: - 혐기성 유해균 ( Clostridum perfingens ), 호기성 유해균 ( Staphylococcus aureus ) - 한국식품연구원으로부터 분양받아 계대배양하였다 - 사용배지: RCM broth, MRS broth, Nutrient broth (Difco, USA) 0 액체배양 - 이눌린 5 g+증류수 50 ml 혼합 - 여과된 이눌린 추출물 70℃ 가온, 용해, 여과지(Whatman No.2) 여과 멸균필터(membrane filter sterilized, pore size 0.2 μm)로 제균, 감압농축 미생물배양용 이눌린을 조제 - 액체배지 10 ml+활성화된 균주 100 μl 분주+제균, 감압농축 이눌린을 각각 0, 0.3%, 0.5% (wt/vol) 농도로 조절 - 37℃ 24시간 배양: 각각 0, 10, 15, 20, 24, 36, 48시간 째 배지 Spectrophotometer, 660 nm, 흡광도 측정 - 혐기성 균주 처리: anaerobic chamber(5% hydrogen, 5% CO2, balanced nitrogen., Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, UK)에서 수행 - 혐기성 균주의 배양: Gas-Pak Ⓡ system(BBL microbiology system,. Cockeysville, USA)을 이용, 혐기적 조건하에서 실시
미생물 배양
각 균별 Broth(액체) 배지
액체 배지에 균 접종
Spectrophotometer, 660 nm, 흡광도 측정
0 실험동물 및 실험설계
- 로스(Ross× Ross)계통 성감별, 부화 1일령 수컷 브로일러 - 120수, 4처리구× 3반복(30수; 1O수/반복), 완전임의 배치 - 처리구: T1 (대조구), T2 (이눌로프리바이오틱스 0.5% 첨가구), T3 (이눌로프리바이오 틱스 0.7% 첨가구), T4 (이눌로프리바이오틱스 1.0% 첨가구)
0 실험사료 및 사양관리
• • - 실험사료: NRC 사양표준(1994) - 옥수수 대두박 기초 - 이눌로프리바이오틱스의 첨가에 따른 사료원료의 부족부분은 옥수수로 조절 - 조단백질, 대사에너지 함량을 동일한 수준으로 조절 - 서늘한 장소에 보관, 35일 동안 물과 함께 무제한 급여, 24시간 연속조명
0 혈청 면역물질 - 채혈준비; 35일째, 각 처리구의 반복구로부터 3수씩 선정, CO2 흡입마취 - 심장채혈: plain 주사기, 혈액 2 ml, 혈액응고 허용, 3,000 rpm, 10분 혈청 -196℃ 액화질소 급속동결 -20℃ 냉동보관 - 안락사: 경추탈골 - 면역기관: 흉선, 비장, F낭* 무게측정 - 혈청 면역물질 IgG, IgM 측정: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, Bethyl laboratories., Inc., USA), Mockett 과 Rose(2007) 0 맹장 미생물 변화 - 3개 반복구, 3마리 임의선택, 경추탈골 안락사 - 맹장: CO2 하, 유리용기 속으로 채취, 밀봉, 실험실 도착 시까지 얼음 위에서 유지 - 분석 시까지 AnaeroGen sachets가 부착된 anaerobic jar (Oxoid, Hampshire, UK)에 서 혐기상태로 유지 후, 에서 계단식으로 10 -8
Bifidobactera, Lactobacillus, E.coli
희석 및
Samonella
* 균수 조사 - 맹장 내용물을 CO2 하에서 멸균생리식염수(NaCL, 9 g/L)에 혼합, 균질화, 동일한 배지 - 희석된 용액 100 μl를 멸균된 각각의 평판 선택고체배지 ( Bifidobactera , BS배지; Lactobacillus , BL배지; Salmonella , SS 배지; E. Coli , MacConkey 배지)속으로 분주 - 혐기성균에 대한 모든 처리 및 배양은 anaerobic chamber 및 Gas-Pak Ⓡ system으로 조절된 혐기조건하에서 수행 - 혐기성균에 대한 모든 배지는 37℃의 CO2 incubator를 이용해서 40시간 배양, 미생물 카운터 - 결과: 맹장 내용물 g당 균수 (CFU, colony forming unit/g wet cecal content)로서 상용로그를 취하여 제시
○ 면역 중추기관
: 1. 1
차 면역기관
1)
흉선
(thymus) -
병아리 때 기관
(trachea)
좌우 양측에 길게 분포
-
성계가 되면 퇴화되어 결체조직 과 지방으로 변함
–
목 부위에 기관을 중심으로 좌우
-
양측에
7
개씩 총
14
개의 임파조직
, T
임파구
2) F
낭
(bursa of fabricius) –
총 배설강의 윗부분
(
항문 뒤쪽
)
에 위치
, B
임파구
-
부화 후
2-3
주에 급격히 성장하기 시작
2.
2
차 면역기관
1)
비장
(spleen) -
위의 오른쪽에 놓인 작은 적갈색 원반형 기관
-
혈액 내에 들어온 항원을 제거하고 항체를 생산할 수 있는 면역세포 형성
2)
림프절
(lymph nodules) -
장 전체에 걸쳐 고루 분포 3) 하더선 비장: 칠면조(좌측), 닭(우측, a )
0 통계처리 - 처리평균: SAS software의 최소제곱 평균절차 및 일반화 선형모형 (Generalized linear model, GLM) 이용 - 박테리아 균총은 log10으로 변환시킨 후 분석, 평균의 차이는 최소유의차 (Least significant difference, LSD)에 의해서 비교 - 통계적 유의성은 p<0.05
3. 결과 및 고찰
0 미생물의 체외배양(
in vitro
) - See to Fig. 1… Fig.6
0 미생물의 체외배양 결과요약:
* Bifidobacteria 의 성장을 촉진하는 비피도스균의 활성효과 ( bifidogenic effect ) : - 기질로서 이눌린: 유익한 미생물( Bifidobacterium, Lactobacillus ) 이용, 유해균( S. aureus, C. perfringens ) 이용하지 못함 브로일러 사료용 프리바이오틱스로서 이눌린 활용 시, 장내 유익균의 증식 도움? - 유해한 미생물의 경우: - 초기성장; 이눌린 첨가구와 대조구가 비슷한 생육 - 배양후기; 미생물의 성장이 억제 장내 유해균의 생육을 위한 영양원으로서 이눌린을 이용하지 못하는 것으로 확인 -
“
장내에서는 많은 미생물들이 서로 영양원에 대한 치열한 섭취경쟁을 하고 있어서 영양 원의 부족현상이 일어 나므로 (Feter et al., 1983 )
”…
.
이눌린은 비피도박테리아와 같은 유익균을 선택적으로 증식시켜 장내 균총을 개선할 수 있을 것으로 생각됨 !
0 맹장 미생물 0 혈청 면역물질 및 면역기관 무게 See to Table 1, Table 2
0 고찰:
0 맹장미생물 Refer to articles - 이눌로프리바이오틱스를 섭취한 브로일러의 맹장내용물에서 건강을 증진시키는 Bifidobacterium, Lactobacillus 균의 성장을 선택적으로 자극하는 효과가 나타났음 - 이익이 되지 않거나 또는 유해한 병원체 Escherichia coli, Salmonella 의 증식을 억제하 는 것으로 나타났다. - 대조구와 비교해 볼 때, 이눌로프리바이오틱스 처리구의 맹장에서 건강에 유익한 Lactic acid bacteria 와 Bifidobacteria 의 성장이 촉진되었음 - 혈청 면역물질 IgG의 농도가 높아졌음 (Table 2) 이눌로프리바이오틱스를 실제로 이용할 경우, 동물의 설사를 예방하고 성장을 촉진할 수 있는 “항균성장촉진제로서 비피도스균의 활성효과(bifidogenic effect)를 갖을 것으 로 사료됨 (13, 15) .
”
0 혈청 면역물질 및 면역기관 무게 - Refer to articles - 흉선: 이눌로프리바이오틱스 0.5% 처리구를 제외한 이눌로프리바이오틱스의 0.7%, 1.0% 처리구에서 대조 구와 비교할 때, 흉선지수가 유의적으로 증가하였음 - 이눌로프리바이오틱스 처리구 사이에 있어서 통계적인 유의차는 나타나지 않았음 결론적으로, 브로일러 사료 내 이눌로프리바이오틱스의 첨가; - 맹장 미생물에 있어서 Bifidobacterium, Lactobacillus 의 집단을 증가시켰고, Escherichia, Salmonella 의 균수를 감소하였으며, - 혈청 면역글로블린 IgG 함량을 높일 수 있었고, - 주요 면역기관인 흉선세포의 증식능력을 개선할 수 있었다.
“
따라서
이눌로프리바이오틱스
가 세균에 대한 항생제 저항성의 위험을 낮추고, 안전한 가금생산물을 생산하는 데 있어서, 유기축산을 위한 천연 항균성장촉진제로서 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
”
4. 요 약
- 브로일러에서 항균성장촉진을 위한 프리바이오틱스로서 이눌린의 활용가능성이 제시되 었지만, 맹장에서 비피도스균의 활성효과를 개선할 필요가 있다. - 미세캡슐화, 이눌로프리바이오틱스가 브로일러의 맹장에서 비피도박테리아 균총을 증 식시키고 살모넬라균의 집락을 낮출 수 있을 것이라는 가설 을 세웠다. - 국산 돼지감자로부터 추출한 차이가 없었다. 이눌린을 미생물 배양한 후 대조구와 비교하였을 때, - Bifidobacterium longum , Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus casei 유익균주의 성장률은 이눌린 첨가구가 높았다 - Streptococcus aureus, Clostridium perfringens 유해균주의 증식은 처리구 간 - 브로일러는 이눌로프리바이오틱스를 함유하지 않은 대조구 사료, 이눌로프리바이오틱 스 0.5%, 이눌로프리바이오틱스 0.7%, 이눌로프리바이오틱스 1.0% 혼합사료를 섭취 하였다. - 이눌로프리바이오틱스를 섭취한 브로일러의 맹장에서 유익한 Bifidobacterium 은 대조 구에 비해서 유의적으로 높았고, 유해한 미생물로 알려진 하였으나, 이눌로프리바이오틱스 처리구 사이에 있어서 E. coli 와 Salmonella 는 감소 Bifidobacterium, E. coli 와 Salmonella 균수의 유의차는 없었다.
혈청 면역물질 IgG 함량은 이눌로프리바이오틱스 처리구가 대조구에 비해서 유의적으 로 증가하였다.
흉선지수 는 이눌로프리바이오틱스 0.5% 첨가구를 제외한 이눌로프리바이오틱스 0.7%, 1.0% 처리구에서 유의적으로 증가하였다. * 본 연구결과는 돼지감자로부터 추출한 DP 26을 지닌 이눌린을 함유하는 이눌로프리바 이오틱스를 브로일러 사료에 첨가, 급여하였을 때, 맹장에서 비피도박테리아의 선택적 인 증식 및 면역능력을 강화해 줌으로서, 유기축산을 위한 사료첨가용 항균성장촉진제 로서 활용가능성을 시사해준다.
감사의 글 본 연구는 OOO의 2006년도 연구비지원으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.
5. References
1. Chung, C. H.
1306.
and D. F. Day. 2004.
Efficacy of Leuconostoc mesenteroides 13146) isomaltooligosaccharides as a poultry prebiotic. Poult. Sci . 83, (ATCC 1302 2. Dorotea, L. M. and D. N. M. Maris. 2005.
of inulin obtained from artichoke( 1484. Molecular properties and prebiotic effect Cynara scolymus L.). Phytochemistry . 66, 1476 3. Fuller, R. 1989.
Probiotics in man and animals.
……………………………
.
J. Appl. Bacteriol . 66, 365-378.