Transcript Basi biologiche dell`uso delle MSCs Alberto Siclari
Biotecnologie in Ortopedia e Traumatologia : dalle attuali evidenze cliniche alle nuove frontiere
Basi biologiche dell’uso delle MSCs
Dr Eugenio Boux Dr Alberto Siclari P.O. Di Biella ASLBI
Mesenchymal stem cell MSC
CELLULE STAMINALI
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Indifferenziate Capaci di autorigenerarsi ( self renewal) Capaci di differenziarsi in tipi cellulari specifici Capaci di ripopolare un dato tessuto in
vivo
CELLULE STAMINALI EMBRIONALI ADULTE
• • • • •
TOTIPOTENTI : capaci di dar luogo a tipi cellulari embrionali e non.
PLURIPOTENTI : capaci di dar luogo a tutti i tipi cellulari derivati dai tre foglietti embrionali (cellule isolate da un embrione a sei settimane, cellule isolate da feto a termine, da placenta, da sangue cordonale e da tessuti adulti). MULTIPOTENTI : capaci di dar luogo a cellule appartenenti a diversi lineages (cellule staminali dei tessuti adulti, hematopoietic stem cells).
OLIGOPOTENTI : capaci di dar luogo a un ristretto subset di lineage cellulari (neural stem cells, hair bulge stem cells).
UNIPOTENTI : capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare (spermatogonial stem cells).
CELLULE STAMINALI ADULTE
Cellule NON DIFFERENZIATE di organi o tessuti adulti, capaci di AUTORIGENERARSI e di DIFFERENZIARSI nei tipi cellulari del tessuto o organo preso in considerazione
Le cellule mesenchimali staminali
•
Sono conosciute anche come:
• colony forming fibroblastic cells • stromal fibroblasts • marrow stromal stem cells • mesenchymal progenitor cells
• • • • • • Le cellule mesenchimali sono cellule non emopoietiche stromali che hanno la capacità di differenziarsi in diverse linee .
Condroblasti Osteoblasti Adipociti Cellule neurali Miociti
• • E’ possibile guidare le MSCs in uno specifico tipo anche in laboratorio usando adatti fattori di crescita o specifiche sostanze ( ad esempio il blu di toluidina le differenzia in condroblasti ) MF Pittinger et al.Multilineage potential of adult human MSCs Science 1999; 284 :143-7
Dennis J.E. Origin and differentiation of human and murine stroma. (2002) Stem Cells; 20:205-214
CARATTERIZZAZIONE IMMUNOFENOTIPICA DELLE MSC Nome marcatore Tipo cellulare Funzione
CD45 Leucociti Glicoforina CD14 CD50 CD34 CD44 ScaI CD29 Eritrociti Monociti e macrofagi Cellule staminali ematopoietiche (HSC) HSC, cellule satelliti, progenitori endoteliali Cellule mesenchimali HSC, MSC MSC Non espresso sulle MSC.
Proteina di superficie dei progenitori dei leucociti.
Non espresso sulle MSC.
Non espresso sulle MSC.
Recettore del lipopolisaccaride Non espresso sulle MSC.
ICAM 3 Non espresso sulle MSC.
Sialomucina Molecola di adesione e recettore dell’acido ialuronico e dell’osteopontina Stem cell antigen VLA-β chain
Sono cellule mobili?
Le MSCs hanno la capacità di muoversi e rispondono alla chemiotassi .
WR Otto Tomorrow’s skeleton staff MSC and the repair of bone and cartilage Cell Prolif 2004 ; 37: 97-110 Dopo le microfratture si ritrovano nell’articolazione J. Kramer et al. “In vivo matrix-guided human mesenchymal stem cells” Cellular and molecular life sciences 2006,vol 63 n°5 pp. 616-626
Le funzioni delle MSCs
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Supportare l’ematopoiesi Attrarre le HSC (hematopoietic stem cells) circolanti nel midollo (homing) Immunosoppressione Riserva di cellule Produzione di sostanze bioattive ( magazzino!)
supportare l’ematopoiesi
Le MSC supportano l’ematopoiesi attraverso interazioni cellula- cellula.
attrarre le HSC nel midollo (homing)
effetto immunosoppressivo
Le MSC hanno un ruolo importante nella maturazione dei linfociti T, B e NK e delle cellule dendritiche.
Riserva di cellule
•
Costituiscono una popolazione residente nel midollo osseo capace di differenziare in cellule del tessuto adiposo, del tessuto cartilagineo, del tessuto osseo e nello stroma che supporta l’ematopoiesi.
Differenziamento osteogenico
Acido ascorbico Desametasone Β Glicerofosfato
Osteoblasti MSCs
Differenziamento condrogenico
Acido ascorbico Insulina hTGFβ1 Poli- lisina
Condrociti MSCs
Sostenze bio-attive
• Sostanze anti-apoptosi / citoprotettive • Antifibrotiche • Angiogenetiche • Mitotiche • ?????
Dove sono le MSCs ?
• • • Tessuto adiposo Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH: Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng 2001, 7:211-228.
Periostio De Bari C, Dell'Accio F, Luyten FP: Human periosteum-derived cells maintain phenotypic Rheum 2001, 44:85-95 . Membrana sinoviale • • • • • • • • Muscoli Bosch P, Musgrave DS, Lee JY, Cummins J, Shuler T, Ghivizzani TC, Evans T, Robbins TD, Huard J: Osteoprogenitor cells within skeletal muscle. J Orthop Res 2000, 18:933-944.
, Derma Young HE, Steele TA, Bray RA, Hudson J, Floyd JA, Hawkins K, Thomas K, Austin T, Edwards C, Cuzzourt J, 2001, 264:51-62.
Midollo osseo
• • Le prime evidenze validanti l’esistenza di una popolazione staminale mesenchimale nel midollo risalgono al 1970 . Friedstein mise in coltura campioni di midollo osseo umano e dopo 4 ore allontanò le cellule non aderenti.
Si erano formati piccoli foci di cellule aderenti composti da 3-4 cellule; queste cellule erano dormienti per circa 4 giorni e poi cominciavano a proliferare. Dopo alcuni passaggi in coltura queste cellule tendevano a diventare più omogenee e dalla forma affusolata.
MSC dal sangue periferico
• • La possibilità di isolare MSC dal sangue periferico (PB-MSC) è ancora molto dibattuta. La frequenza delle MSCs nel sangue è molto bassa, tuttavia, sotto la stimolazione di citochine, ormoni e fattori di crescita, che vengono secreti nel sangue in diverse condizioni patologiche, il numero di queste cellule aumenta.
• • Non è chiaro la loro origine né la loro funzione in vivo; è noto che le MSC possono ritornare dagli organi periferici al midollo ma non è chiaro se possano persistere nel sangue e costituire una popolazione staminale residente.
Aspirato midollare
• Il midollo osseo contiene tre tipi principali di cellule : endoteliali 0,1 % ematopoietiche 99,5% MSC 0,4%.
Concentrazione dell’aspirato midollare
• • centrifugazione filtrazione selettiva • • concentrare la componente cellulare e portare il volume a 6-10 cc con un numero di cellule fino a 9 volte superiore rispetto all’aspirato midollare ......ma da dove partiamo prima della concentrazione ?
Il numero delle cellule
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Il fattore piu’ importante !
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Quante sono le MSC presenti nel bacino del nostro paziente?
Variabili
• • 1) Variabilità individuale Evento valutabile solo a posteriori dopo il prelievo 2) Sede del prelievo in uno stesso individuo Bacino
Variabili
• • 3) Traumi recenti nella sede del prelievo “ consumo “ delle cellule 4) Malattie endocrine carenza estrogeni 5) Tabacco L’uso di tabacco influenza sicuramente la vitalità delle cellule mesenchimali e quindi il rischio di ottenere meno cellule deve essere tenuto presente . Non esistono al momento studi che mettano in rapporto il numero di sigarette fumate e il numero di MSCs
•
Variabili
6) Farmaci che influiscono sulla fisiologia del midollo osseo.
Chemioterapici 7) Tumori in fase attiva In particolari per le neoplasie che elettivamente metastatizzano alle ossa. E´ noto come le cellule stromali mesenchimali tumorali (TDMC) che crescono accanto e frammiste alle CT in molte neoplasie possano essere parzialmente responsabili del loro sviluppo. L´interazione reciproca tra CT e lo stroma mesenchimale circostante è stata dimostrata nei tumori primari e nelle loro sedi metastatiche ed in particolare nelle ossa. Le TDMC forniscono un ambiente ottimale per la proliferazione delle TC grazie al reciproco scambio di molecole solubili e della matrice extracellulare, anche coinvolgendo cellule endoteliali e cellule della risposta immune. Il rischio di reclutare TDMC controindica questa procedura
Variabili
• • • • 8) Abuso di alcool 9) Età e sesso Sono le variabili piu’ studiate .
E’ stata analizzata la popolazione di cellule mononucleate e dei progenitori degli osteoblasti presenti nel midollo osseo di individui di età differenti, suddivisi in maschi e femmine per studiare se il sesso e l’età possano influenzare la concentrazione cellulare.
Variabili
Numero delle MSC s maschi : decresce da 38 10 6 (30 aa) a 25.5 10 6 cells/ ml ( 70 aa) femmine : decresce da 56 10 6 (30 aa) a 19.5 10 6 cells/ml (70 aa). Muschler GF, Nitto H, Boehm C, Easley K. Age- and gender-related changes in the cellularity of human bone marrow and the prevalence of osteoblastic progenitors. J Orthop Res. 2001 Jan;19(1):117-25