Transcript Diaporama de génétique

DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES
GENETIQUES
1°) Indications
a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de
transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à
l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et
semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
1°) Indications
a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de
transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à
l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et
semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
1°) Indications
a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de
transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à
l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et
semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
1°) Indications
a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de
transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à
l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et
semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Recherche de mutations récurrentes
Un gène – une mutation
Un gène-des mutations majoritaires
… de nombreux outils adaptés
Maladie de Huntington
Allèles anormaux
(> 36 CAG )
Allèles normaux
( 30 CAG )
Diagnostic Direct et analyse fonctionnelle
Syndrome de retard mental lié à l ’X
• Le Gène :
– Gène FMR1, localisé en Xq27.3
– FMRP : RNA binding protéine
– Présence d ’une expansion d ’un motif trinucléotidique répété
« CGG » au niveau de l ’extrémité 5 ’non traduite du gène
(CGG)n
...Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine- Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine...
Diagnostic Direct
Syndrome de retard mental lié à l ’X
F
H
5,2 kb
EcoRI normal
PM
2,8 kb
EcoRI+EagI normal
Blot
Femme mosaïque
Homme mosaïque
Femme mutée
Homme muté
Femme prémutée
Homme prémuté
M
Femme normale
M
Homme normal
• Southern Blot
Muté
Méthylé
NI
Prémuté
No Méthyl
NA
Interprétation des profils
Diagnostic direct d ’une lésion de l ’ADN par PCR
EXON
M T
M T
45
pm
3
43
50
13
Dystrophie
musculaire
de
Duchenne
48 Deux réactions permettent
d ’amplifier simultanément à
19 l ’aide de 18 couples d ’amorces
spécifiques, 18 exons du gène de la
17 dystrophine et les jonctions
introns-exons correspondantes.
5
60
Elles permettent ainsi de
diagnostiquer la délétion d ’un ou
12 plusieurs de ces exons chez les
malades atteints de myopathie de
44 Duchenne/Becker.
52
4
6
47
8
Oligonucleotide Ligation Assay
A
Fluorochrome
Sonde commune
G
C
ADN Normal
Ligation
dénaturation
G
OLA Normal
Oligonucleotide Ligation Assay
G
Fluorochrome
Sonde commune
A
T
ADN Muté
Ligation
dénaturation
A
OLA muté
OLA
1°) Indications
a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de
transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à
l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et
semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Recherche de mutations inconnues
Techniques multiples de détection
Sequence
nt 1311 CT
Heterozygous
Codon 317 CAG  TAG
Controls
nt 1311 CT
Controls
Size marker
Undigested
R317X
Control
PAX6 Nonsense Mutations Exon 11 (R317X)
PCR/HaeIII
SSCP
DGGE
1°) Indications
a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de
transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à
l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et
semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
• Critères d’implication d’une variation nucléotidique dans
un phénotype (pathologique)
– évident (modification radicale de la protéine)
• Absence d’ARNm ou de protéine
• Perte de la fonction de la protéine in vitro ou dans un modèle (test
fonctionnel)
• modification de l’ARNm
– Arguments probabilistes
• Histoire familiale
– corrélations mode de transmission/ phénotype ; phénotype/génotype
• Arguments biologiques (éventuellement in sillico)
– nature du changement d’acide aminé
– éloignement du consensus pour une séquence signal
– ...
• Comparaison en population
– mutations comparables et leurs effets pathogènes
– conservation du résidu modifié dans une famille de gène
(intraspécifique) ou une analyse phylogénétique (interspécifique)
– présence de la variation dans une population normale comparable
1°) Indications
a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de
transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à
l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et
semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Le Diagnostic Indirect
Marqueur 1
Ici
Marqueur 2
Marqueur 3
Marqueur 4
1°) Indications
a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de
transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à
l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et
semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Diagnostic Indirect (affection AD)
1°) Indications
a) Conseil génétique et diagnostic anténatal
b ) Diagnostic de confirmation
c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique)
2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de
transmission mendélien ) diagnostic direct.
a) problèmes posés par les mutations récurentes
b) problèmes posés par les mutations inconnues
i) diagnostic direct évident
ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire
3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à
l ’anomalie
a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et
semi-directe)
b ) analyse familiale
c) diagnostic probabiliste
Phénomène de recombinaison
m
1cM
+
3cM
m
ou
P=0,01
+
m
ou
P=0,03
+
m
ou
+
P=0,0003
• 4°) Prescription
– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal
–
–
–
–
–
a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
b) obtention du consentement éclairé
c) prise en charge de la grossesse en cours
d) rendu des résultats
e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• 4°) Prescription
– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal
–
–
–
–
–
a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
b) obtention du consentement éclairé
c) prise en charge de la grossesse en cours
d) rendu des résultats
e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• Le consentement éclairé
• Le consentement éclairé
– Obligatoire
• doit porter sur des
renseignements précis
• doit faire l’objet d’un
document écrit
• doit être compris par le
patient ou ses ayant-droits
– Les cas particuliers
• enfants
– les titulaires de l’autorité
parentale et éventuellement
l’enfant lui même
• les majeurs incapacités
– tuteur ou curateur
• les impossibilités
– personne de confiance
déclarée
– famille
• L’attestation d’obtention du
consentement.
–
–
–
–
–
–
–
Unicité de la recherche
Autorisation du laboratoire
Découvertes fortuites
Incertitude sur le succès
Durée des examens
Conservation des échantillons
Modalités de rendu
diagnostique
– Caractère facultatif
• 4°) Prescription
– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
– Abord du patient
– Lecture d’un compte rendu d’analyse moléculaire pour le
praticien
• 5°) Le diagnostic anténatal
–
–
–
–
–
a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
b) obtention du consentement éclairé
c) prise en charge de la grossesse en cours
d) rendu des résultats
e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• Rendu des résultats
– par le médecin prescripteur du test
• qui est le seul destinatiare des résultats…
– Au cours d’une consultation appropriée
– Eventuel suivi
• Lecture d’un compte rendu de diagnostic moléculaire à
l’usage du praticien
– Notion de nomenclature internationale des mutations
Nomenclature des mutations
• Description au niveau nucléotidique
– Base de description
• la séquence génomique : g.
• La séquence de l’ADNc : c.
– Les substitutions
• g.11223G>A = substitution d’une guanosine par une adénosine en
position 11223 de la séquence
• c.542T>C (le nucléotide N° 1 est le premier nucléotide du codon
d’initiation de la traduction (A de l’ATG))
• Cas des introns
– c.641+2T>A ou IVSn+2T>A
– c.642-1G>T ou IVSn-1G>T
• Séquence de référence précisée.
– Les délétions et les insertions
• « del » ou « ins »
• c.266_271del6 ou c.266_271delTTACCA
• Description au niveau protéique
– p.Q36X ou p.Gln36stop ou p.Gln36X
– p.R40W ou p.Arg40Trp
• Description de mutation à effet plus complexe
– Exemple mutations décalantes du cadre de lecture
• c.642_643insCfsX18
• p.Ala214AlafsX6
• Lecture du compte rendu
– 1°) la technique employée
– 2°) le résultat brut
• Présence d’une mutation [c.24C>T]+[=] dont l’impact protéique est
[p.Lys8Arg]+[=]
– 3°) le commentaire
• La mutation p.Lys8Arg présente à l’état hétérozygote est décrite de
manière récurente dans la population européenne. Elle est responsable
du phénotype du patient. Elle se transmet en dominance et, sa
présence doit faire conseiller une consultation spécialisée de
génétique pour informer le proposant des risques et engager une
éventuelle enquête familiale.
• Précisions, questions et description des mutations
complexes :
– http://www. dmd.mutnomen.html
• 4°) Prescription
– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal
–
–
–
–
–
a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
b) obtention du consentement éclairé
c) prise en charge de la grossesse en cours
d) rendu des résultats
e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• 4°) Prescription
– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal
–
–
–
–
–
a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
b) obtention du consentement éclairé
c) prise en charge de la grossesse en cours
d) rendu des résultats
e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• Consentement de la femme
enceinte
• Elle a eu et compris les
informations suivantes
– Mode de pratique du DPN
– Nature et limite des examens
réalisés
– Risques liés au prélèvement
– Délai d’obtention des résultats
– Remise et explication des
résultats
• Il n’y a en acun cas un
engagement à la réalisation
d’une interruprion de la
grossesse si le fœtus est atteint
de la maladie recherchée
• 4°) Prescription
– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal
–
–
–
–
–
a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
b) obtention du consentement éclairé
c) prise en charge de la grossesse en cours
d) rendu des résultats
e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
CHORIOCENTESE
et / ou
PLACENTOCENTESE
Utérus
Embryon / Foetus
• Date :
- Choriocentèse: 10 - 14 SA
- Placento :
15 - 35 SA
• Villosités : annexes
• Risque : - F.C. 1 à 1,5 %
- erreur
• Intérêt :
- gène ++++
- chs ++
- enzyme +++
Pince
Chorion / Placenta
1%
AMNIOCENTESE
utétus
aiguille
•
•
•
Date: 14 - 30 SA
Cellules Amniotiques
Risque: - F.C.
0,5 %
- erreur 1/10000
•
Intérêt: - gène
++
- chs ++++
- enzyme +++
- hormone ++++
fœtus
CORDOCENTESE
utérus
aiguille
Cordon
ombilical
• Date:
• Sang Foetal
• Risque: - F.C.
22 - 38 SA
1%
- erreur
• Intérêt:
1/1000
- gène +
- chs +++
- enzyme ++
fœtus
• 4°) Prescription
– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal
–
–
–
–
–
a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
b) obtention du consentement éclairé
c) prise en charge de la grossesse en cours
d) rendu des résultats
e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• 4°) Prescription
– a) consultation préalable appropriée
– b) obtention du consentement éclairé
– c) rendu des résultats
• 5°) Le diagnostic anténatal
–
–
–
–
–
a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s)
b) obtention du consentement éclairé
c) prise en charge de la grossesse en cours
d) rendu des résultats
e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical
• Diagnostic d’une “maladie
d’une particulière gravité
reconnue comme incurable au
moment du diagnostic”
• Prise de décision
multidisciplinaire
–
–
–
–
Néonatologiste
Echographiste
Obstétricien
Généticien
• Organisé en Centre de
Diagnostic Prénatal
• Références :
– Génétique moléculaire humaine T. STRACHAN , AP READ,
Flammarion Médecine-Sciences (2ème édition française 1998)
– Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire,
clinique. Collège National des enseignants et praticiens de
Génétique Médicale, 2004, MASSON
– Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire,
clinique. Collège National des enseignants et praticiens de
Génétique Médicale,
• http://college-genetique.igh.cnrs.fr/sommaire.html