Transcript Fermentationszeit [h]

Respiration Activity Monitoring System
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S. 1
Bioprozessoptimierung
Bioprozessoptimierung
Online – Bestimmung
der Atmungsaktivitäten
(OTR, CTR, RQ)
Respiration Activity Monitoring System
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S. 2
in Schüttelkolben
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S. 3
Das Tablar
Anwendungsgebiete
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S. 4
 Online-Verfolgung der Stoffwechselaktivität
von pro- und eukaryotischen Kulturen in Schüttelreaktoren
Anwendungsgebiete
Einfache Ermittlung von Kenngrößen:
Sauerstofftransferrate (OTR)
Kohlendioxidtransferrate (CTR)
Respirationsquotient (RQ)
maximale Wachstumsrate (µmax)
…,
S. 5
volumetrischer Sauerstoffübergangskoeffizient (kLa)
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die ein sicheres Scale–Up ermöglichen.
Anwendungsgebiete
 Schnelle Erkennung von charakteristischen
biologischen Phänomenen. OTR Verläufe:
Substratlimitierung
(außer C-Quelle)
Diauxie
Fermentationszeit
Sauerstofftransferrate
= gesamter
Sauerstoffverbrauch
[mol/l]
Fermentationszeit
S. 6
Produktinhibierung
( z.B. pH, Temp.)
maximale
Sauerstofftransferkapazität
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Fermentationszeit
Sauerstofftransferrate
Fermentationszeit
Fermentationszeit
Sauerstofflimitierung
Sauerstofftransferrate
Sauerstofftransferrate
Sauerstofftransferrate
Unlimitiertes Wachstum
auf Minimalmedium
Anwendungsgebiete
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S. 7
 Schnelle Erkennung von charakteristischen
biologischen Phänomenen.
CTR-Verläufe:
Anwendungsgebiete
 Ermittlung geeigneter Bedingungen für das
konventionelle Massenscreening
(Versuchsdauer, Medien, Betriebsbedingungen …)
 Optimieren von Substratkonzentrationen und
Reduzierung der Entwicklungszeiten für Medien
 Wachstumskontrolle unter sterilen Bedingungen
 Gezielte Probennahme nach der Sauerstofftransferrate
 Qualitätskontrolle
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S. 8
 Bilanzieren von Fermentationen (Toxizitäts- und
Proliferationsassays)
Stand der Technik
OnlineAbgasanalytik
?
gerührter
Bioreaktor
geschüttelter
Bioreaktor
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S. 9
online
OTR
CTR
RQ
Motivation
„Die Nachteile des Schüttelkolbens als
Experimentiersystem, sind die, dass der
Experimentator nur sehr begrenzte
Möglichkeiten der Überwachung und
Regelung hat.“
Hilton, 1999
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„Die Schwäche von small-scale
Flüssigfermentationen:
diskontinuierliche Überwachung“
S. 10
Payne et al., 1990
Was wird gemessen?
Kohlenstoffquelle
(Glutamin, Glucose, ...)
Spurenelemente,
Vitamine
Stickstoffquelle
(Ammonium, Harnstoff,
Hefeextrakt, Pepton, ...)
Produkt
(Alkohol, Proteine,
Aminosäuren, ...)
Kohlendioxid
S. 11
Schwefelquelle
(Sulfat, Cystein, ...)
Sauerstoff
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Phosphorquelle
(Phosphat, Phytin)
Unbekannter
Fermentationsverlauf
Normaler Schüttelkolben:
Kulturverlauf
A
?
Zeit
Versuchsende
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S. 12
B
Bekannter
Fermentationsverlauf
Kulturverlauf
A
B
B
Zeit
Versuchsende
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S. 13
A
Lösung
bestimmt online die
Atmungsaktivitäten (OTR, CTR, RQ)
von aeroben Mikroorganismen
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Bedingungen
S. 14
in Schüttelkolben unter sterilen
Klare Vorteile
 Mehr Informationen über die mikrobiologischen
Prozesse im Schüttelkolben
 Schnelle Charakterisierung und gezielte Optimierung von Medien
 Ersetzt teure Versuche im Fermenter
 Paralleltechnik (Zeit, Vergleichbarkeit, …)
 Einfache Handhabung
 Quasi-Non-Stop-Betrieb durch sehr kurze Rüstzeiten
 Reduzierung der Versuchsdauer auf die tatsächlich
erforderliche Zeit
 Unterscheidung betriebsbedingter und biologischer Effekte
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 Erkennung des optimalen Inokulierungszeitpunktes
S. 15
 Schafft optimale Screeningbedingungen
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S. 16
Messkolben
Beispielfermentationen
Ermittlung der optimalen Inokulierungs– und
Fed-Batch– Startzeit
OTR/CTR [mol/(L·h)]
Tierische Zellkultur Hybridoma
(50 mL Kulturvolumen)
Glutamin- und
Glucoseverbrauch
0
50
Glucoseverbrauch
100
150
200
Fermentationszeit [h]
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S. 17
Zelldichte [N/mL]
OTR
CTR
Zelldichte
Beispielfermentationen
Medienoptimierung am Beispiel:
Osmolalitätsoptimum
Wachstumsrate µ [h-1]
Tierische Zellkultur Hybridoma
(50 mL Kulturvolumen)
0,03
Das Osmolalitätsoptimum
liegt bei 0,318 osmol/kg
0,025
0,02
0,01
0,005
0
0,22
0,24
0,26
0,28
0,3
0,32
0,34
0,36
0,38
Osmolalität [osmol/kg]
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S. 18
0,015
Beispielfermentationen
Vergleich von RAMOS mit einem
Rührkesselfermenter mit Abgasanalytik
OTR [mol/(L·h)]
Tierische Zellkultur Hybridoma
Dipl.-Ing. M. Canzoneri
Rührkesselfermenter (2 Liter Kulturvolumen)
0
20
40
60
80
Fermentationszeit [h]
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S. 19
RAMOS (0,05 Liter Kulturvolumen)
Beispielfermentationen
Einfluss verschiedener Flüssigkeitsvolumina
Kolben 1 : 10 mL
Kolben 2 : 15 mL
Kolben 3 : 20 mL
Kolben 4 : 30 mL
Kolben 5 : 40 mL
Kolben 6 : 50 mL
S. 20
Sauerstofflimitierung
Fermentationszeit [h]
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OTR [mol/(L·h)]
Bakterium Corynebacterium glutamicum
Beispielfermentationen
Einfluss verschiedener
Substratkonzentrationen
S. 21
1x konzentriert
2x konzentriert
4x konzentriert
Fermentationszeit [h]
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OTR [mol/(L·h)]
Bakterium Pseudomonas fluorescens
Beispielfermentationen
Medium- und Prozessoptimierung
Medium mit 100% Komp. 1,
30 mL Flüssigkeit
Medium mit 200% Komp. 1,
30 mL Flüssigkeit
S. 22
Medium mit 200% Komp. 1,
20 mL Flüssigkeit
Fermentationszeit [h]
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OTR [mol/(L·h)]
Hefe Hansenula polymorpha
Beispielfermentationen
Zellwachstum innerhalb eines
RAMOS-Versuchs
S. 23
Dipl.-Ing. M. Canzoneri
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Tierische Zellkultur Hybridoma
Beispielfermentationen
Zellwachstum innerhalb eines
RAMOS-Versuchs
Tierische Zellkultur Hybridoma
Zelldichte [N/ml]
Dipl.-Ing. M. Canzoneri
40
80
120
160
Fermentationszeit [h]
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0
S. 24
8-fach Parallelmessung
Handhabungsvorteile
 Geringer Platzbedarf –
RAMOS passt auf einen normalen Labortisch
 Quasi-Non-Stop-Betrieb durch sehr kurze Rüstzeiten
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 Komplett automatisierte Anwendersoftware
S. 25
 Einfaches und schnell erlernbares Handling
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S. 26
Bedienoberfläche
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S. 27
Kolbenübersicht
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S. 28
Sauerstofftransferrate (OTR)
Detailansicht für jeden
einzelnen Kolben (OTR, CTR, RQ)
C-Quelle (Glucose)
verbraucht
Ethanol verbraucht
exp-Phase
Sauerstofflimitierung
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S. 29
lag-Phase
O2-, CO2 - Transfer
Sauerstofftransfer (OT)
Kohlendioxidtransfer (CT)
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S. 30
 Bilanzierung des gesamten
Sauerstofftransfers über den Fermentationsverlauf
maximale Wachstumsrate µ
Wachstumsrate µ
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S. 31
maximale Wachstumsrate µ
Bringen Sie Licht in Ihre Prozesse
S. 32
CTR
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OTR
OTR [mol/(L·h)]
Wirtschaftlichkeitsbetrachtung
Medium mit 100% Komp. 1,
30 ml Flüssigkeit
Medium mit 200% Komp. 1,
30 ml Flüssigkeit
 Optimierung der Fermentationszeit
 Amortisationszeit: ca. 6 Monate
 Zusatznutzen: Vermeidung von Fehloptimierungen
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Fermentationszeit [h]
S. 33
Medium mit 200% Komp. 1,
20 ml Flüssigkeit
Zellkultur (Hybridoma)
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S. 34
• Dosierung
FTT® Fluid-Train System
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S. 35
• Dosierung und Probenahme
FTT® Fluid-Train System
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S. 36
• Geregelte Dosierung
RQFeed™
● Bestimmung von RQ durch OUR, CER online Messungen
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S. 37
● exakte Fütterung der Kulturen
● signifikant erhöhte Produktionsrate
● Verkürzung der Fermentationszeiten
CellDrum™ - Zellkraftmessung
Reproduzierbare biomechanische Messung
Personalisierte Medikamenten- und Toxinforschung
Ersatz für Tierversuche
Integrierte, vollautomatische
und heißsterilisierbare Pipettiereinheit
● 24 - 96 Multiwell Einheit mit integrierter Sensorik
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S. 38
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●
●
HiSense™ - Präzisionsabgasanalytik
S. 39
1 bis 8(5) Messkanäle für 1 bis 4 Fermenter
Hochauflösende Messung (-c Version)
Feuchtekorrektur (-c Version)
„Echte“ OUR, CER und RQ Messung (-c Version)
Geringe Querempfindlichkeit
Überdruck möglich
Verschleißfreie Sensorik
Kompakt
Zusatzfunktionen integrierbar
Opt. frei programmierbar
Viele Kopplungsmöglichkeiten
Datenexport möglich
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Zellkultur (Hybridoma)
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S. 40
• Ohne Dosierung
Zellkultur (Hybridoma)
© HiTec Zang GmbH - HRE
S. 41
• Dosierung auf OTR geregelt ab RQ < 1
Zellkultur (Hybridoma)
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S. 42
• Dosierprogramm
Zellkultur (Hybridoma)
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S. 43
• Parametrierung der Probenahme
Kooperationen und
Veröffentlichungen
Kooperationen:
Fachhochschule Aachen, Abteilung Jülich
Labor für Zellkulturtechnik
Prof. Dr. Manfred Biselli
Technische Hochschule Aachen,
Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs
 Stöckmann Ch., Maier U., Anderlei T., Knocke Ch., Gellissen G., Büchs J.,
The Oxygen Transfer Rate as Key Parameter for the Characterisation of Hansenula polymorpha
Screening Cultures, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 613-622, 2003
 Anderlei T., Zang W., Büchs J., Online respiration activity measurement (OTR, CTR, RQ)
in shake flasks, Biochem. Eng. J. 17(3), 187-194, 2004
 Lotter St., Büchs J. Utilization of power input measurements for optimisation of culture
conditions in shaking flasks, Biochem. Eng. J. 17(3), 195-204, 2004
 Losen M., Lingen B., Pohl M., BüchsJ., Effect of oxygen-limitation and medium composition
on Escherichia coli in small-scale cultures, Biotechnol. Progress. (accepted)
© HiTec Zang GmbH - HRE
 Anderlei T., Büchs J., Device for sterile online measurement of the oxygen transfer
rate in shaking flasks, Biochem. Eng. J. 7(2), 157-162, 2001
S. 44
Veröffentlichungen: