Transcript Aportes del Laboratorio

7ma. Reunión Científica y 21º Reunión anual de Unidades Centinela para Hepatitis Virales
15 y 16 Octubre 2012
Expandiendo horizontes para“ un Programa Nacional de Control”
Hepatología 1: Actualización en Hepatitis B:
Aportes del Laboratorio
Mg Sara Vladimirsky
Servicio Hepatitis y Gastroenteritis Virales
Servicio Hepatitis y Gastroenteritis
Lab. Nacional de Referencia
INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán"
INEI Carlos G Malbrán
[email protected]
HBV : M. ELECTRÓNICA EN SUERO
C
A
B
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A: partículas esféricas de 22 nm ( HBsAg),
B: Patrícula Viral Completa de 42 nm
C: Formas tubulares o filamentosas (HBsAg)
EL VIRUS DE LA HEPATITIS B
Antigeno de superficie
HBsAg
Nucleocápside
HBcAg
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DNA
GENOMA HBV
Determinante a
Mutantes de la
polimerasa (pueden
afectan expresión
de HBsAg)
Mutantes core
Promotor del precore
Stop precore
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CICLO
REPLICATIVO
Sintesis de
ccc DNA
DEL HBV
5´
5´
2.1 kb
2.4 kb
3´
AAA
3´
AAA
Transcripción de
RNAm
Pr.
Envoltura
3.5 kb
Síntesis de
proteínas
Encapsidación con
RNA pregenómico
core
Envoltura y
Secreción
pol
DNA
Genómico
Retrontranscripción
Reversa
DIAGNÓSTICO DE HEPATITIS B
MARCADORES DIRECTOS
HBsAg
HBeAg
HBV-DNA
MARCADORES INDIRECTOS
antiHBs
antiHBc
antiHBcIgM
antiHBe
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CURSO SEROLÓGICO
Síntomas
HBeAg
anti-HBe
HEPATITIS AGUDA B CON
RECUPERACIÓN
anti-HBc total
IgM anti-HBc
anti-HBs
HBsAg
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
52
100
Semanas después de la exposición
Agudo
Crónico
(6 meses)
(años)
anti-HBe
HBeAg
HBsAg
anti-HBc Total
PROGRESIÓN A
INFECCIÓN CRÓNICA
HBV
IgM aHBc
0
4 8 12 16 20 24 28 32 36
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52
años
www.cdc.gov/ncidod/diseases/Hepatitis/slideset/index.htm
CONCLUSIONES DEL CONSENSO
ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011:
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
1. Métodos serológicos
Tabla 1: Perfiles serológicos más comunes.
HBsAg
Anti HBc
total
Anti HBc
IgM
Anti HBs
NEG
NEG
NEG
NEG
POS
POS
POS
NEG
POS
POS
NEG
POS
NEG
POS
Hepatitis B resuelta
POS
POS
NEG
NEG
Hepatitis B crónica
NEG
NEG
NEG
Interpretación
Sin contacto con HBV
Hepatitis B aguda; reactivación aguda de
infección crónica
Infección aguda en resolución; observado en
POS/NEG
Hepatitis B fulminante
NEG
POS
Respuesta a vacuna o transferencia
pasiva por administración de
gamaglobulina
http://www.aaeeh.org.ar/img-noticias-portada/aaeeh_consenso_hb.pdf
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CONCLUSIONES DEL CONSENSO
ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011:
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
Tabla 2: Otros perfiles serológicos.
HBsAg
Anti HBc
total
Anti HBc
IgM
Anti HBs
POS
POS
NEG
POS
NEG
POS
NEG
NEG
POS
NEG
NEG
NEG
Interpretación
Hepatitis B crónica
Hepatitis B resuelta, falso positivo,
Hepatitis B crónica (En orden de
frecuencia)
Hepatitis B aguda temprana;
antigenemia fugaz post vacunación,
tolerancia inmune, mutantes
defectivos e inmunosuprimidos.
(Evaluar HBeAg y HBV-DNA
Cuantitativo)
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FASES DE LA INFECCIÓN CRÓNICA
Tolerancia
Inmune
Fase
Inmunoactiva
HBeAg
Reactivación
Replicación
baja/nula
HBeAg-/antiHBe+
HBV-DNA
ALT
HC leve
HC moderada/severa
HAI<4
HC moderada/severa
cirrosis
cirrosis
cirrosis
HC HBeAg Pos
Portador Inactivo
HC HBeAg Neg
Resolución: HBsAg – antiHBs+
Fattovich (2003) Seminars in Liver Diseases
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HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR EN LA HEPATITIS B
Para qué?
Detectar y cuantificar genomas virales
Secuenciarlos y
Genotipificarlos
Identificar sustituciones nucleotídicas o aminoacídidas
clínicamente relevantes (espontáneas o inducidas por el
tratamiento)
como, a quien, cuando?
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HBV DNA EN SUERO
 Marcador confiable de replicación de HBV.
 Nivel de HBV DNA : depende de la fase de infección :
Hepatitis aguda
Portación crónica :
Inmunotolerancia
Inmuno-eliminación
Latencia Clínica
Reactivación
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Pico
alto, sostenido
bajo, fluctuante
muy bajo, no detectable
alto
DETECTAR Y CUANTIFICAR GENOMAS VIRALES: CÓMO?
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Valsamakis. Molecular Testing in the Diagnosis and Management of
Chronic Hepatitis B. CMR Julio 2007, p. 426–439
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE HEPATITIS B
Cuantificación del HBV-DNA:Cuando/A
quien?
Estudio del Estado Replicativo de Portadores Crónicos del HBsAg
(HBeAg Pos y HBeAg neg): definir la fase de Infección Crónica
Decisión de Tratar
Monitoreo del tto
Evaluación del Riesgo de evolución a
Cirrosis y HCC
Investigación Clínica de nuevas drogas.
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Perfomances similares, con sensibilidades acordes a las necesidades para
tomar decisiones clínicas (aunque distinto límite de detección atribuída al
volumen de muestra utilizado)
Mayores falsos positivos y desvios estándar con extracciones manuales
Rangos lineales semejantes (7 log IU/ml), muestras por encima del rango
deben ser diluidas con procedimientos validados por el laboratorio
Aunque los valores obtenidos con los distintos métodos son similares, las
variabilidades intra e interensayo son diferentes, por lo que se sigue
recomendando testear al paciente siempre con el mismo método
No
se estudio dependencia del genotipo
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MÉTODOS DISPONIBLES Y SUS RANGOS DINÁMICOS
Gish, Clinics in Liver Diseases 2007:11(4):761-795
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CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011
EQUIPOS APROBADOS EN LA ARGENTINA
Cobas Taqman HBV Test
(Roche)
Ampliprep Cobas Taqman HBV Test (Roche )
Abbott Real Time,
(Abbott Molecular)
Versant HBV bDNA
(Siemens)
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HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR EN LA HEPATITIS B
Para qué?
Detectar y cuantificar genomas virales
Secuenciarlos y
Genotipificarlos
Identificar sustituciones nucleotídicas o aminoacídidas
clínicamente relevantes (espontáneas o inducidas por el
tratamiento)
como, a quien, cuando?
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Schiff,
http://www.medscape.org/viewarticle/510444_2
DETERMINACIÓN DE GENOTIPOS / ESTUDIO DE
VARIANTES Y MUTANTES: CÓMO?
H.M. diferencial luego de PCR
RFLP
LiPA
Secuenciación (gold estándar)
Etc etc (más de 10 métodos)
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(Guirgis, 2010)
GENOTIPOS DEL HBV:
Cuando y a quien?
Importantes sociedades científicas…. han recomendado más estudios para
establecer la correlación entre los genotipos de HBV y la evolución clínica antes
de recomendar el uso del genotipo en el manejo de la hepatitis
Guirgis, 2010; IJIF 14 (2010) e941–e953
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CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011
GENOTIPIFICACIÓN
GENOTIPIFICACIÓN
• El
genotipo del HBV ha sido reconocido como un factor predictivo de respuesta al
tratamiento con interferón. El genotipo A tiene buena respuesta, mientras que la
respuesta del genotipo D es pobre.
• El genotipo es una herramienta útil, sin embargo en la decisión terapéutica
individual el genotipo no debería por sí mismo definir la decisión de tratamiento.
En nuestro medio debe evaluarse su valor como predictor
de respuesta, especialmente en el genotipo F, predominante
en la región.
•
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HERRAMIENTAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR EN LA HEPATITIS B
Para qué?
Detectar y cuantificar genomas virales
Secuenciarlos y
Genotipificarlos
Identificar sustituciones nucleotídicas o aminoacídidas
clínicamente relevantes (espontáneas o inducidas por el
tratamiento)
como, a quien, cuando?
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IDENTIFICACIÓN DE MUTANTES PRECORE
Habitualmente, se realiza a través de la combinación de los
parámetros virológicos, bioquímicos e histológicos.
HBsAg Positivo
HBeAg (-) / anti-HBe (+)
HBV DNA a títulos altos
 Evidencia de daño hepático: ( ALT generalmente elevada,
o evidencia histológica de inflamación)
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Valsamakis, CMR, Julio 2007:426–439
Test para estudio de Resistencia antiviral
Reaparición en suero del HBV DNA después de un periodo de
indetectabilidad o elevación mayor a 1 log por encima del nadir
en un paciente con rspuesta terapéutica documentada .
La resistencia se puede demostrar por estudios:
Fenotipicos
Secuenciación
LIPA
En la práctica se la considera por el aumento en la
carga viral en el paciente con respuesta
documentada al tto.
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Valsamakis, CMR, Julio 2007:426–439
CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011
DETECCIÓN DE RESISTENCIA A ANTIVIRALES
4. Detección de resistencia a antivirales
La resistencia a antivirales refleja la susceptibilidad reducida de un virus a los efectos inhibitorios de una
droga tras un proceso en el que se pone de manifiesto la presencia de mutaciones de resistencia al
iniciarse la terapia.
• Mecanismos de Resistencia viral
El desarrollo de resistencia se asocia a la presencia de mutaciones que desencadenen cambios en
aminoácidos de la polimerasa viral afectando la capacidad de unión de la droga antiviral a la región blanco.
• Diagnóstico de Resistencia
Existen test para determinar resistencia genotípica y fenotípica. En nuestro medio no hay test disponibles
para determinar resistencia fenotípica, sin embargo si los hay para resistencia genotípica (implica
determinar las mutaciones asociadas a la generación de resistencia a los antivirales). Se puede realizar
mediante:
◊ Secuenciación directa de productos de amplificación del dominio RT de la región de la
polimerasa (rt160-rt260). No existen métodos comerciales disponibles y son utilizados
métodos in house para realizarlo.
◊ Test de hibridación reversa (Lipa) que consiste en hibridar el HBV-DNA amplificado
con sondas de oligonucleótidos inmovilizadas en tiras de nitrocelulosa. Tienen la
desventaja de no detectar todas las mutaciones actuales vinculadas al fallo terapéutico.
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INTERPRETACIÓN DE LA CUANTIFICACIÓN Y DISMINUCIÓN
DEL HBV-DNA Y DEL HBSAG EN SUERO
Brunetto J Hepatol 2010
Viriones
Viriones + partículas defectivas
(exceden a los viriones x
102-105)
Replicación
HBV-DNA en suero
replicación de HBV
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Replicación
Transcripción cccDNA/
Traducción mRNAs
HBsAg en suero
Transcripción cccDNA/ Traducción mRNAs
POTENCIALES APLICACIONES DEL MONITOREO DE
LOS NIVELES DE HBSAG
Aplicaciones
Potenciales
Durante la historia
natural
Durante la Terapia
Beneficios
Identificación de portadores inactivos
No tratar a quien no lo necesita
Identificar a los pacientes que
necesitan terapia ahora o aquellos que
es probable reactiven en un futuro
cercano
Identificar a los pacientes que
necesitan un monitoreo más
cercano y posible identificación
de los que necesiten tratamiento
Identificación de pacientes que:
es poco probable respondan al PEGIfn,
Pacientes respondedores rápidos
Reglas de detección de la terapia
Pacientes que experimentan una rápida
declinación de los niveles de HBsAg
Identificar pacientes que tienen
alta chance de aclarar el HBsAg
y establecer reglas de detección
del tto para los que no
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Motivación
Liaw. Hepatology, 2011:54(2)
ENSAYOS CUANTITATIVOS DE
HBSAG (QHBSAG)
Existen
dos
ensayos
comerciales
disponiples : Architect HBsAg QT
(Abbott) y HBsAgII quant (Roche; Elecsys
II-Cobas-e).
Ambos
se
encuentran
totalmente automatizados.
Se trata de EIE en dos pasos sobre
microparticulas por quimioluminiscencia.
Sus resultados se expresan en UI/ml .
HBsAg QT:
rango dinámico: 0,05-250 UI/ml (Abbott)
HBsAgII quant:
rango dinámico: 0.05-130UI/ml (sin diluir),
rango dinámico:5-13000 UI/ml
(prediluidas). (Roche)
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CONCLUSIONES DEL CONSENSO ARGENTINO DE HEPATITIS B – 2011
ENSAYOS CUANTITATIVOS DE HBsAg
Son ensayos comerciales (Abbott, Roche) diseñados y controlados para la cuantificación del HBsAg
contra un estándar internacional. Su uso no reemplaza al ensayo cualitativo.
GENOTIPIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DEL ANTÍGENO DE SUPERFICIE
• Los niveles séricos de HBsAg se asocian con el nivel de ccc-DNA y correlacionan indirectamente con el
control de la infección. Por lo tanto se ha investigado su utilidad en la definición de las diferentes fases de
la historia natural de la infección HBV y para definir la probablilidad de respuesta al tratamiento a
través de su cinética durante el mismo.
En ambas circunstancias debe destacarse que no reemplaza a la determinación
del DNA sérico sino que brinda información complementaria.
•
• Los niveles séricos de HBsAg serían útiles en:
1. La diferenciación entre la fase de inmunotolerancia y la de inmunoeleiminación en pacientes con niveles
bajos de transaminasas.
2. El diagnóstico diferencial entre el portador crónico inactivo e inmunoescape.
• Respecto la utilidad del HbsAg cuantitativo en el monitoreo de la respuesta terapéutica, se ha sugerido
que la cinética de declinación del HBsAg sérico en conjunto con la determinación de la carga viral tendría
valor predictivo de respuesta especialmente en pacientes tratados con interferón. Su rol debe establecerse
en estudios que validen su utilidad. Es necesario definir técnicas de determinación, valores de corte, y las
semanas de tratamiento en las que debe ser realizado.
La cuantificación del HBsAg es de gran utilidad, sus indicaciones
precisas serán determinadas en un futuro cercano.
•
http://www.aaeeh.org.ar/img-noticias-portada/aaeeh_consenso_hb.pdf
Servicio Hepatitis y Gastroenteritis
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EL FUTURO?
Nuevas aplicaciones para conocidos marcadores
Cuantificación del HBeAg
Estudio de los intermediarios replicativos del HBV: cccDNA
(hígado/suero)
Nuevas Tecnologías
Next generation sequencing
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CUANTIFICACIÓN DE HBEAG
(MÉTODOS COMERCIALES AÚN NO DISPONIBLES)
Utilidad Potencial:
Para estratificar los pacientes entre seroconvertidores espontaneos y pac que requeriran tratamiento
Monitoreo de tto con inferferon y con nucleósidos
Nguyen, Hepatol Int (2009) 3:S5–S15
La medición cuantitativa del HBeAg durante la terapia podría ser superior al HBsAg y al HBV-DNA como
predictor de la seroconversión del HBeAg
Tangkijvanich P Hepatol Res. 2010 Apr;40(4):269-77.
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DETECCIÓN DE cccDNA
En:
Tejido hepático
células monocucleares periféricas y de médula,
plasma.
Métodos:
Real Time PCR
“Invader”
Utilidad:
Conocer aspectos de la dinámica de la replicación durante la infección natural y bajo tto
Predictor de Respuesta a la terapia antiviral
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Valsamakis, CMR, Julio 2007:426–439
NEXT-GENERATION SEQUENCING
Los nuevos métodos de secuenciación ofrecen nuevas oportunidades pero
también crean nuevos desafíos porque generan gran cantidad de datos, y
sus resultados pueden ser dificiles de interpretar.
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Chevalliez, Gastroenterology 2012:142:1303-1313
NEXT-GENERATION SEQUENCING
Ventajas:
Permite estudiar poblaciones virales minoritarias.
La “profundidad” lograda al momento parece ser suficiente para detectar
poblaciones virales minoritarias en mezclas de quasispecies complejas.
Se puede distinguir si diferentes sustituciones están presentes en el mismo
virus o en distintos
Desventajas
El significado clínico de las poblaciones minoritarias no siempre es claro
Puede ser dificil distinguir sustituciones verdades de errores generados por la
reacción de secuenciación
Desafíos
Se necesitan mejorar las herramientas bioinformáticas que contribuirán a
transformar la información generada en información util para la toma de
decisiones terapéuticas
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Chevalliez, Gastroenterology 2012:142:1303-1313
UTILIDAD DE MARCADORES SEROLÓGICOS Y VIROLÓGICOS EN EL
DIAGNOSTICO Y MONITOREO DEL TRATAMIENTO DE LA
HEPATITIS B
Marcador
Clinical trials
Practica
Investigación
ALT en suero
Si
Si
NO
HBeAg/antiHBe
Si
Si
NO
HBV-DNA
Si
Si
NO
Resistencia
genotípica
SI
SI*
SI
Genotipo
Si
NO*
SI
HBsAg cuantitativo Cuando está disponible NO
SI
Análisis de
quasiespecies
Cuando está disponible
NO
SI
cccDNA hepático
Cuando está disponible
NO
SI
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Adaptado de Pawlotzky, Gastroenterology. 2008
134(2): 405–415
SERVICIO HEPATITIS Y GASTROENTERITIS
DEPARTAMENTO VIROLOGIA
LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA
INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS (INEI)
ADMINISTRACION NACIONAL DE LABORATORIOS E INSTITUTOS DE
SALUD (ANLIS)
“Dr. Carlos Gregorio Malbrán”
http://www.anlis.gov.ar/INEI/virolog/hepatitis
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