Transcript Frankia

Aktinoryza i jej znaczenie
Aktinoryza to symbioza pomiędzy wiążącym azot promieniowcem z
rodzaju Frankia oraz korzeniami niektórych drzew i krzewów
okrytonasiennych. Wiązanie azotu odbywa się w aktinoryzowych
brodawkach indukowanych przez Frankia na korzeniach roślin
aktinoryzowych.
Wiązanie azotu przez rośliny aktinoryzowe może osiągać wydajność
od 2 do 360 kg N/ha/rok co jest .porównywalne z wydajnością tego
procesu u roślin motylkowych żyjących w symbiozie z Rhizobium.
Azot związany przez Frankia jest dostarczany roślinie-gospodarzowi,
a także jest wydzielany do gleby, dzięki czemu uzupełnia niedobory
azotu. Aktinoryza jest procesem ważnym w gospodarce leśnej i w
procesie rekultywacji gleby.
Rośliny aktinoryzowe – makrosymbiont
Frankia tworzy symbiozę z ok. 220 gatunkami dwuliściennych roślin
okrytozalążkowych należących do 23 rodzajów i 8 rodzin (m.in.
Casuarinaceae, Myricaceae, Eleagnaceae, Rhamnaceae,
Betulaceae). Najważniejszą rośliną aktinoryzową w Polsce jest olsza
Alnus sp.
Przykłady roślin aktinoryzowych, innych niż olsza:
Casuarina (Australia)
Woskownica (Myrica; ang.: bayberry)
Oliwnik (Eleagnus)
Olsza, podobnie jak inne gatunki aktinoryzowe, należy do tzw.
roślinności pionierskiej; zasiedla tereny ubogie w azot jak gleby
piaszczyste, żwirowate, mokradła, nieużytki, gleby zdegradowane.
Sugeruje się użycie tej rośliny jako rotacyjnej, poprawiającej jakość
gleby, lub jako domieszkę w lasach składających się z drzew
szczególnie ważnych z ekonomicznego punktu widzenia
(sąsiedztwo olszy korzystnie wpływa na wzrost innych drzew).
Przykład:
Frankia – mikrosymbiont
Frankia jest Gram-dodatnim, powoli rosnącym, tlenowym
promieniowcem o strzępkach podzielonych poprzecznymi
przegrodami. Grzybnia promieniowca tworzy charakterystyczne
terminalne zgrubienia, zwane „pęcherzykami”. Pęcherzyki otoczone
są wielowarstwową ścianą zbudowaną z lipidów. Kształt
pęcherzyków jest zależny od żywiciela. U Alnus mogą być kształtu
buławkowatego, pałeczkowatego lub sferycznego. Wewnątrz
pęcherzyków odbywa się wiązanie azotu.
Schemat budowy przykładowego pęcherzyka (za Małek, 1993):
Obok grzybni i pęcherzyków Frankia tworzy sporangia z
nieruchliwymi sporami. Sporangia mogą być okrągłe lub
nieregularne, a także wielokomorowe, podzielone przegrodami
poprzecznymi i podłużnymi.
Wewnątrz brodawek olszy, jak i w czystej kulturze, Frankia
może tworzyć wszystkie trzy struktury morfologiczne: grzybnię,
pęcherzyki i sporangia (pęcherzyki nie powstają w pożywkach
zawierających azot związany; znane też są brodawki Sp(-) nie
zawierające spor lub jedynie nieliczne spory). W brodawkach
pęcherzyki występują w skupieniach, tzw. „vesicle clusters”.
Pierwsza publikacja o izolacji Frankia z korzeni Alnus glutinosa
w Polsce:
Uzyskany szczep Frankia, wykazywał wszystkie cechy typowe dla
symbiontów aktinoryzowych:,
.....z tworzeniem sporangiów, pęcherzyków oraz ich skupisk („vesicle
clusters”):
Proces brodawkowania
Sposoby infekowania korzeni roślin przez Frankia są zależne od
gatunku gospodarza. U olszy w kontakcie z Frankia następuje
skręcanie włośników i ich deformacja. Frankia namnaża się
wewnątrz włośników i otacza tkanką rośliny-gospodarza.
Namnażanie się wewnątrz korzenia zbiega się w czasie z
wytwarzaniem komórek miękiszu korowego, co uwidacznia się
nabrzmieniami na korzeniach, zwanych przedbrodawkami. Wskutek
dalszego rozwoju brodawek tworzą się pierwotne płaty brodawkowe;
są to zmodyfikowane korzenie boczne.
Przekrój podłużny przez płat brodawki
Casuarina, zabarwiony floroglucynolem.
Widoczne są silnie zabarwione,
zlignifikowane strefy infekcji przez Frankia
[wg R. H. Berga, cyt. za Bensonem (2008)]
Aktinoryzowe brodawki są strukturami wieloletnimi (3-10 lat)
z rocznym cyklem wzrostu i starzenia się. Najmłodsza, najbardziej
aktywna tkanka jest zlokalizowana na obrzeżach płata brodawki.
Brodawki olszy są zwarte; mogą osiągać znaczną wielkość (do kilku
cm średnicy).
Przykłady brodawek różnych gatunków olszy:
Cytologia i ultrastruktura brodawek:
Pęcherzyki sferyczne
w komórkach brodawek
olszy
Silniejsze powiększenie przekroju
brodawki olszy; widać septy
w pęcherzykach
Brodawki u różnych roślin aktinoryzowych (kolejno od lewej):
Casuarina
glauca, Alnus
incana subsp. rugosa, Casuarina sp., Morella pensylvanica
Efektywność brodawkowania i wiązania azotu
atmosferycznego jest uzależniona od wielu czynników
środowiskowych (może być osłabiona przez nadmiar azotu
nieorganicznego, suszę, obniżenie temperatury, zbyt niskie pH,
brak fosforu i innych biopierwiastków, nieobecność innych
drobnoustrojów ryzosferowych). Proces brodawkowania znajduje się
pod kontrolą czynnika hormonalnego (istotne znaczenie mają
zwłaszcza auksyny i cytokininy).
Wiązanie azotu
Frankia wiąże azot w pęcherzykach symbiotycznych.
Pęcherzyki zawierają enzym FeMo nitrogenazę. Jest on
nieodwracalnie inaktywowany przez tlen u wszystkich organizmów
wiążących azot atmosferyczny. Uważa się, że u Frankia ściana
komórkowa pęcherzyków chroni enzym przed inaktywującym
działaniem tlenu.
Azot związany w symbiozie aktinoryzowej jest przenoszony
do rośliny jako NH3 / NH4+. NH3 może być toksyczny, jeśli zostaje
zakumulowany. Jednak w obojętnym pH komórki szybko przechodzi
w NH4+ i jest asymilowany przez roślinę drogą: syntaza
glutaminianowa – glutaminiano-oxo-glutarowy system
aminotransferaz. W reakcjach transaminacji powstaje cytrulina,
najważniejszy związek azotowy transportowany w ksylemie rośliny.
Mechanizmem pozyskiwania energii wewnątrz brodawek jest
hydrogenaza.
Aktywność nitrogenazy w brodawkach korzeniowych jest
uzależniona od aktywności fotosyntezy w liściach, co sugeruje
ścisły związek obu procesów.
Przypuszcza się, że molibden w cząsteczce nitrogenazy,
w warunkach in vitro może być zastąpiony przez wanad, mangan
lub chrom.
Podstawowe reakcje wiązania azotu przez Frankia, można wg
Bensona (2008) przedstawić następująco (vide nast. przeźr.):
Frankia, podobnie jak i inne bakterie diazotroficzne, wytwarza
hydrogenazę, która umożliwia odzyskanie części elektronów –
straconych wskutek produkcji H2 przez nitrogenazę (Benson, 2008).
Dzięki efektywnemu wiązaniu azotu przez Frankia, rośliny aktinoryzowe są organizmami pionierskimi – mogącymi zasiedlać środowiska skrajnie ubogie w azot:
Poprawę wzrostu siewek olszy na podłożach bezazotowych, można
uzyskać nie tylko w drodze szczepienia czystą kulturą Frankia – ale
także zawiesiną zmiażdżonych brodawek:
Szczepienie Frankia, umożliwia wykorzystywanie przez roślinęgospodarza biopierwiastków zawartych w skałach takich, jak bazalt
– wskutek wietrzenia skał:
Izolowanie Frankia
Frankia występuje najliczniej w glebach porośniętych
brodawkującymi roślinami aktinoryzowymi, ale promieniowca
znajdowano także w glebach pozbawionych roślin żywicielskich
(w tym także w środowiskach ekstremalnych, jak gleby zasolone,
kwaśne, mokradła, wydmy). Liczebność Frankia w glebie określa
się pośrednio przy użyciu metody brodawkowania. Bezpośrednie
izolacje Frankia z gleby bardzo rzadko kończą się sukcesem.
Zazwyczaj Frankia izoluje się z brodawek korzeniowych. Istnieją
trzy główne przyczyny, z powodu których izolacja i hodowla są
utrudnione: (1) długi czas wzrostu Frankia, (2) specyficzne
wymagania odżywcze, (3) obecność innych mikroorganizmów
w brodawkach.
Pozycja taksonomiczna Frankia wg Bensona (2008):
Znane są następujące metody izolowania Frankia:
-
seryjnych rozcieńczeń,
-
mikrosekcji,
-
selektywnej inkubacji,
-
wirowania w gradiencie sacharozy,
-
filtracji.
Metoda filtracji Bensona (1982) jest uważana za najbardziej
wydajną procedurę izolacji. Opiera się na stwierdzeniu, że skupienia
pęcherzyków („vesicle clusters”), uwolnione z tkanek brodawki w
trakcie ich homogenizacji, mają około 20-50 μm średnicy. W czasie
filtracji tkanki brodawek zatrzymują się na filtrze o porach 50 μm, a
skupienia pęcherzyków na 20 μm oczkach.
Dr David R. Benson, Professor of Microbiology,
Department of Molecular & Cell Biology U-3125,
University of Connecticut,
Storrs, CT 06269-3125,
Phone: 860-486-4258,
e-mail: [email protected]
Mikroorganizmy inne niż Frankia zostają oddzielone od pęcherzyków w trakcie przemywania sterylną wodą destylowaną. Materiałem
zebranym z filtra o porach 20 μm szczepi się bezazotowe pożywki
dla Frankia. Po 4-8 tygodniach inkubacji w temperaturze 25-30C
można zaobserwować charakterystyczny dla promieniowców
wzrost. Izolaty zalicza się do Frankia na podstawie 5 kryteriów:
1. morfologia (wytwarzanie pęcherzyków i sporangiów)
2. budowa chemiczna ściany komórkowej i błon komórkowych
3. serologia
4. homologia DNA
5. infekcyjność i / lub efektywność w symbiozie z rośliną
żywicielską.
Uproszczone kryteria dotyczą morfologii, zdolności wiązania azotu
oraz zdolności do infekcji roślin żywicielskich i tworzenia
efektywnych symbioz.
===================================================
Przykładowe hodowle wytrząsane Frankia – w kolbach – bez (po
lewo) i z dodatkiem polimeru Carbopol (po prawo):
Część praktyczna
Materiał: brodawki korzeniowe olszy czarnej Alnus glutinosa,
wiążący azot szczep Azospirillum (kontrola pozytywna)
Badanie aktywności nitrogenazy w brodawkach (metodą
redukcji acetylenu):
- - do badania użyć świeżych brodawek,
--- oddzielić poszczególne płaty brodawek i umieścić w trzech
probówkach o pojemności 12 cm3 po 3,5 g lub - w przypadku
mniejszej ilości materiału- w probówkach o pojemności 2,5 cm3 po
0,8 g (brodawki wypełniają probówkę do połowy jej wysokości),
- - probówki zamknąć szczelnie gumowymi, sterylnymi korkami
"serum stopper",
- - w jednej z trzech probówek sprawdzić wolną pojemność probówki
(wlewając do brodawek ilościowo wodę "pod korek" przy użyciu
pipety szklanej o pojemności 10 cm3)
- z dwóch pozostałych probówek usunąć strzykawką powietrze i
wprowadzić acetylen (nową strzykawką) tak, aby stanowił on 10%
całkowitej wolnej pojemności probówki,
- po 2 godz. inkubacji w temperaturze 30C pobrać z probówek
1 ml (lub 0,2 ml) próbki gazowe i zbadać w nich zawartość etylenu
przy użyciu chromatografu gazowego (kolumna o wymiarach 2 m x
1,8 mm wypełniona Porapak R, 80-100 mesh, temperatura kolumny
700C, dozownika i detektora 1000C, gaz nośny azot z przepływem
40 cm3/min, detektor FID),
- zanalizować dane przy użyciu programu komputerowego:
"Chrom-Anal",
- obliczyć wg wzoru Martennsona ilość nm etylenu/próbkę/godz,
a następnie przeliczyć ilość etylenu na 1 g świeżej masy brodawek:
A= % C2H4/100 x [(PV/RT) x 109] / t
A - aktywność nitrogenazy (nm C2H4/próbkę/godz),
% C2H4 - % powierzchni piku etylenu z chromatografu gazowego,
P- ciśn. atmosferyczne (~ 1,0 atm)
V- objętość acetylenu (C2H4) wstrzykniętego do probówki (ml),
R- stała gazowa = 82,054 ml x atm/mol/K,
T - temperatura w stopniach Kelvina (273 + C)
t - czas inkubacji próbki z acetylenem.
(Schemat badania – poniżej)
2. Badanie wiązania azotu przez szczep Azospirillum:
- - do badania użyć szczepu wyhodowanego w bezazotowej
pożywce Rennie (pożywka nie zaszczepiona będzie stanowiła
"ślepą próbę"),
- - zastąpić korek z waty na sterylny "serum stopper",
- - z probówki za pomocą strzykawki usunąć 0,7 cm3 powietrza
(10%) znad pożywki i dodać taką samą ilość acetylenu,
-
- inkubować hodowlę w 30C przez 2 godz. (lub dłużej)
- - do dozownika chromatografu gazowego wstrzyknąć 1 cm3
próbki gazowej pobranej znad pożywki, zbadać w próbce zawartość
etylenu,
- aktywność nitrogenazy wyrazić w nmolach
etylenu/hodowlę/godzinę wg wzoru Martennsona.
3. Izolowanie Frankia metodą filtracji Bensona
-
- oddzielone płaty brodawek przepłukać pod bieżącą wodą
- - przeprowadzić powierzchniową sterylizację brodawek
używając 2,5% podchlorynu sodu (zastosować preparat Ace w
rozcieńczeniu 1:1, do rozcieńczenia użyć sterylnej wody
destylowanej), do podchlorynu dodać kroplę Tween 20, brodawki
wytrząsać na mieszadle magnetycznym przez 25 min.,
(schemat – poniżej):
l
Czas 25-minutowego
mieszania brodawek
przy sterylizacji powierzchniowej brodawek –
proszę wykorzystać na
liczenie kolonii na
płytkach z ćwiczenia 2!
- brodawki przepłukać 5-krotnie niewielką ilością wody sterylnej,
- w sterylnych warunkach pociąć brodawki na bardzo drobne
kawałki, odrzucając wierzchołki,
- przeprowadzić homogenizację skrawków brodawek w sterylnym,
szklanym homogenizatorze w niewielkiej ilości sterylnej wody,
- filtry o porach 50 i 20 μm wysterylizować 1% podchlorynem sodu
- 1 min., po czym kilkakrotnie przepłukać sterylną wodą,
- homogenat przefiltrować przez oba filtry stosując do
przepłukiwania duże ilości sterylnej wody,
- materiał z filtra o porach 20 μm, będący właściwym inokulum,
przenieść do sterylnej probówki,
- sprawdzić obecność pęcherzyków Frankia ("vesicle clusters")
w
zawiesinie
pod
mikroskopem,
uzyskaną
zawiesiną
zaszczepić 10 probówek
z bezazotową pożywką dla
Frankia.
Główne źródło ilustracji i innych informacji:
Benson D.R., 2008: Frankia & Actinorhizal Plants. Copyright  D.
R. Benson, Department of Molecular & Cell Biology, University of
Connecticut, Storrs, CT 06269-3125.
http://web.uconn.edu/mcbstaff/benson/Frankia/FrankiaHome.htm#
(19.X.2008)
Literatura
1. Akkermans A.D.L., Hafeez Z., Roelofsen W., Chaudhary A.N.,
1984. Ultrastructure and nitrogenase activity in pure culture and
in actinorhizas of Alnus, Colletia and Datisca spp. [w] Advances
in Nitrogen Fixation Research, red. C. Veeger, W.E. Newton,
Nijhoff/Junk Pudoc, The Hague, s. 311. (cyt. za Małek, 1993)
2. Benson, D. R. 1982. Isolation of Frankia strains from alder
actinorhizal root nodules. Appl. Environ. Microbiol. 44: 461-465.
3. Benson D.R., 2008: Frankia & Actinorhizal Plants. Copyright  D.
R. Benson, Department of Molecular & Cell Biology, University
of Connecticut, Storrs, CT 06269-3125.
http://web.uconn.edu/mcbstaff/benson/Frankia/FrankiaHome.ht
m# (19.X.2008)
4. Dahm H., 2000. Aktinoryza i mikoryza na korzeniach olszy. Wyd.
IBL i CZLP, str. 77-83.
5. Król M.J., Zielewicz-Dukowska J., 2005. Genetyczne aspekty
wiązania N2 bakterii z rodzaju Azospirillum. Post. Mikrobiol., 44(1):
47-56.
6. Li C.Y., Bormann B.T., and Chang T.T., 2005. Restoration of
degraded soil ecosystems and maintenance of long-term site
productivity by actinorhizal plants. In Jamaluddin Jamaluddin (ed.)
Biofertilizers. pp. 1-12.
7. Li C. Y., Strzelczyk E., and Pokojska A., 1996. Nitrogen-fixing
endophyte Frankia in Polish Alnus glutinosa (L.) Gaertn. Microbiol.
Res. 151: 371-374.
8. Małek W., 1993. Symbioza roślin okrytozalążkowych z Frankia,
promieniowcem wiążącym azot atmosferyczny. Post. Mikrobiol.,
32(4): 337-350.
9. Marcinowska K., 1997. Promieniowce wiążące azot atmosferyczny
[w] Drobnoustroje w środowisku – występowanie, aktywność
i znaczenie. W. Barabasz i J. Grzyb. (red.): 403-416. Wyd. AR
Kraków.
10. Strzelczyk E., 2000. Znaczenie aktinoryzy dla leśnictwa. Sylwan,
144(4): 7-15.
====================================================
Filmy (a raczej „filmiki”) nt. aktinoryzy i Frankia na str. D.R. Bensona:
„Vesicles – The Movie” (monitoring hodowli Frankia)
„3-D Hyphae in Datisca cells” (rekonstrukcja z mikr. konfokalnego)
Dziękuję za uwagę ;-)