Transcript Aspetti microbiologici: dalla raccolta dei campioni all`interpretazione

Aspetti microbiologici:
dalla raccolta dei campioni
all’interpretazione critica dei risultati
24 Novembre 2010
dott.ssa Claudia Venturelli
obiettivi
RICERCA ED ERADICAZIONE
DELL’AGENTE INFETTIVO
2.
IDENTIFICAZIONE DELLA PROBABILE
FONTE D’ INFEZIONE:
• Respiratoria
• Addominale
• Cutanea
• Vie urinarie
• SNC
• Protesi e cateteri
1.
La Diagnosi
Colture appropriate devono essere sempre ottenute
prima di iniziare la terapia antibiotica.
Per ottimizzare l'identificazione degli organismi che
causano l'infezione, devono essere prelevate almeno
due emocolture di cui una per via percutanea ed una
prelevata attraverso ciascun catetere vascolare, a
meno che il catetere non sia stato introdotto di
recente (< 48 ore). E’ raccomandato il prelievo prima
della terapia antibiotica e secondo quanto richiesto
dalla clinica, di colture da altri siti come urina, fluido
cerebrospinale, ferite, secrezioni delle vie respiratorie
o altri fluidi corporei.
La terapia antibiotica
La terapia antibiotica deve essere iniziata
possibilmente entro la prima ora dal
riconoscimento della sepsi grave, dopo il
prelievo delle colture appropriate.
La terapia antibiotica
Il regime antimicrobico iniziale deve
sempre essere rivalutato dopo 48-72 ore
sulla base dei dati microbiologici e clinici,
con lo scopo di impiegare antibiotici a
spettro più stretto per limitare lo sviluppo di
resistenze, ridurre la tossicità, ridurre i
costi. (DE-ESCALATION)
Il controllo del focus infettivo
In ogni paziente con sepsi grave si deve
valutare se è presente un focus infettivo
sensibile alle misure di controllo, nello specifico
il drenaggio di un ascesso o di un focus locale
di infezione, l'asportazione di tessuto necrotico
infetto, la rimozione di un presidio
potenzialmente infetto o del controllo definitivo
di un focus che si sta infettando per
contaminazione microbica .
Bundle (fascio/pacchetto):
a. insieme di interventi applicati ad un processo morboso che,
se usati contemporaneamente, danno un outcome migliore
rispetto alla applicazione individuale.
Sepsis resuscitation bundle
0-6 ore
 Sepsis management bundle
entro 24 ore

Non appena il paziente avverte il brivido e /o
segni e sintomi di febbre
La rapidità di esecuzione in rapporto all’evento
cruciale , perché …
1. La batteriemia è nella maggior parte dei
casi un evento acuto e fuggevole
2. La clearance microbica è molto rapida
3. Il picco febbrile segue la poussee
batteriemica di 30-60 min.
Quanti prelievi effettuare ?

Effettuare almeno 2 prelievi :
1 da vena periferica
1 da CVC
Paralleli = Allo stesso tempo
 Non scartare la prima quantità di sangue
prelevato perché è quella con la più alta
concentrazione di microbi
 Contraddistinguere ciascun prelievo con
l’etichetta corrispondente alla modalità di
prelievo.
 Indicare su ciascun prelievo l’ora
CVC
CVC
Vena
Periferica
Vena
Periferica
Modalità di prenotazione in
Hospital Web
delle emocolture parallele e seriate
Cosa fare nel caso di cateteri a due vie ?
Nel caso di cateteri a piu’ lumi (ramo bianco e
rosso) eseguire 3 prelievi:
 1 da vena periferica
 1 dal lume rosso
 1 dal lume bianco
Tutti allo stesso tempo
Ricordarsi di applicare le corrispondenti
etichette correttamente ed indicare il tipo di
lume sul flacone
Come conservare e inviare i flaconi alla Microbiologia ?

I flaconi, tenuti a temperatura ambiente,
dovrebbero pervenire alla Microbiologia il
prima possibile ed essere posti
immediatamente negli appositi incubatori
L’emocoltura deve essere ripetuta nei giorni
successivi ?
No. Non ci sono indicazioni per il prelievo nei giorni
successivi per il follow up, perché quest’ultimo si basa
sui dati clinici.
 Ci sono due eccezioni:
- l’endocardite (la persistenza dell’infezione può
richiedere una modifica della terapia)
- le sepsi da S. aureus in cui il prelievo dopo 2 e 4 giorni
può fornire utili indicazioni di complicanze infettive
insorte per via ematogena (es. endocardite o
osteomielite) o per estensione dell’infezione in altre
sedi (tromboflebite settica, ascessi).


Non eseguire colture di routine dei cateteri
rimossi da pazienti in unita intensiva.

Analizzare microbiologicamente solo quei
cateteri sospettati di essere la fonte
dell’infezione o la causa della sepsi
Infatti fino al 20% dei cateteri venosi centrali sono
colonizzati
alla rimozione; la maggior parte non sono associati con
infezioni locali o batteriemie/fungemie.
Questo sottoporrebbe a lavoro inutile e al rischio di terapie
antibiotiche inappropriate
LIQUIDI BIOLOGICI (peritoneale, ascitico, biliare)
Eseguire il prelievo prima della terapia antibiotica
CAMPIONI DI LIQUIDI CORPOREI RACCOLTI DA ASPIRAZIONE PERCUTANEA
1. Pulire il sito della puntura con alcool e antisepsi del sito di aspirazione.
2. Aspirare in asepsi il campione di liquido necessario con siringa e ago sterili.
3. Introdurre immediatamente una parte di liquido nei flaconi per aerobi ed anaerobi.
4.Un prelievo Adeguato è costituito da almeno 0,5 cc di fluido o tessuto trasportato al
laboratorio per la ricerca degli anaerobi
CAMPIONI DI LIQUIDI CORPOREI RACCOLTI DA TUBI DI DRENAGGIO
La raccolta di liquidi da drenaggio deve essere scoraggiata in favore di una diretta aspirazione
dall’area drenante
1.
Disinfettare il tubo con una soluzione disinfettante, lasciare asciugare ed aspirare il liquido.
2.
Introdurre il campione nei contenitori sterili come da protocollo di laboratorio.
3.
La coltura di fluidi da drenaggi posizionati da piu’ di 2 giorni potrebbe non essere
attendibile.
TRASPORTO DEL CAMPIONE
1.
Inviare in laboratorio quanto prima possibile.
2.
Non refrigerare.
Sepsi addominali: quando e quali colture?
Si raccomanda l’esecuzione di un solo prelievo in
quantità sufficiente da inviare in microbiologia per
la ricerca degli anaerobi ed aerobi in apposito
terreno di trasporto
Il tampone non costituisce un idoneo campione
per la ricerca degli anaerobi
SodomkinJS, et al. Clin Infect Dis.2003;
37: 997-1005
Sepsi addominali: quando e quali colture?
I prelievi dai drenaggi addominali possono
condurre a risultati errati per la contaminazione
della porzione distale del drenaggio, con
conseguente copertura antibiotica non necessaria
SodomkinJS, et al. Clin Infect Dis.2003;
37: 997-1005
Ascessi ed essudati da ferita chirurgica
INDICAZIONI GENERALI
 Raccogliere i campioni preferibilmente prima di
iniziare la terapia antibiotica
 Pulire la cute circostante con soluzione fisiologica
sterile.Per ferite chiuse e aspirati: Antisepsi della
cute con soluzione di clorexidina 2% o alcool 75% .
 Per ferite aperte: prelevare un frammento lavando
con soluzione fisiologica sterile prima della raccolta.
Prelevare tessuto infetto piuttosto che un frammento
superficiale. Evitare la raccolta con tampone per la
scarsa significatività, se è possibile eseguire un
aspirato o un prelievo bioptico.
 CONTENITORI: Flaconi per aerobi e anaerobi
TECNICA DI RACCOLTA
Ascessi chiusi:



Aspirare il materiale infetto con ago e siringa, inserire l’ago nel tessuto in
varie direzioni (se possibile).
Se l’aspirazione non porta alla raccolta del campione, si può valutare
l’opportunità di iniettare nel sottocute della soluzione salina sterile e
aspirare nuovamente.
Inoculare il contenuto nei flaconi sterili per aerobi e anaerobi
Pus:
 Aspirare la porzione profonda della lesione o l’essudato, con siringa e
ago sterili.
 Inviare come per ascessi chiusi.
Tessuti e campioni bioptici:
 Raccogliere una quantità sufficiente di tessuto evitando le aree
necrotiche.
 Raccogliere i frammenti di tessuto piccoli nel flacone per aerobi e per
anaerobi
Utilizzare i tamponi solo se non può essere ottenuto
tessuto o aspirato
Per i prelievi da ferita :Rimuovere i frammenti superficiali
tramite irrigazione e pulire con soluzione salina sterile; se la
ferita è asciutta raccogliere due campioni imbevuti di
soluzione salina sterile; ruotare delicatamente il tampone sulla
superficie della ferita per 5 volte, specialmente dove c’è pus o
nelle aree infiammate
TRASPORTO DEL CAMPIONE
 Non refrigerare o incubare prima o durante il trasporto.
 Se non è possibile inviare subito il campione al laboratorio,
mantenerlo a temperatura ambiente.
 Consegnare gli aspirati ed i tessuti al laboratorio entro 30
minuti e comunque il prima possibile

Sistema di prelievo/raccolta specifico per anaerobi :
prelievo con siringa
Sistema di prelievo/raccolta specifico per
anaerobi con tampone
Nuovi scenari nella diagnosi
microbiologica di sepsi
Current Sepsis Test Providers
Company
Product
Name
Blood prep
Method
Detection
Pathogens
Detection
Method
Test
Times
Multiplex PCR
Whole blood
No culture
54 Bacteria
6 Fungi
(Resistances: 3)
Automated CE
or Agarose
SeptiFast
Real-time
PCR
Whole blood
(column)
19 bacteria
6 fungi
(Resistances :1)
Real-Time
(melting curve)
Hyplex®
Blood
Screen
Multiplex-PCR
-ELISA
Blood culture
(column)
10 bacteria
(Resistances :1)
ELISA
Gel
Chip
sequencing
6 hr
Seeplex®
Sepsis Test
Roche
BAG
Health Care
Seegene
Main
Method
4 - 6 hr
6 hr
4.5 - 6 hr
VYOO™
Multiplex PCR
LOOXSTER®
34 bacteria
6 fungi
(Resistances :5)
Molzym
SepsiTest™
Blood
qPCR
MolYsis
28 bacteria
5 fungi
Sequencing
4 - 6 hr
BACTfish
BACTfish™
Sepsis kit
in situ
Hybridization
9 bacteria
3 fungi
Fluorescent
microscope
1 hr
Mobidiag
Sepsis
ProveIt™
Lab-on-chip
13 bacteria
(Resistances :1)
chip
3 hr
SIRS LAB
Blood culture
(column)
3.
Il regime antimicrobico
iniziale dovrebbe
sempre essere rivalutato dopo 48-72 ore
sulla base dei dati microbiologici e clinici, con
lo scopo di impiegare antibiotici a spettro più
stretto per limitare lo sviluppo di resistenze,
ridurre la tossicità, ridurre i costi.
Grado E
MIC = misura della attività
antimicrobica “in vitro”
Utilità per il clinico
 Valutazione comparativa della
possibile efficacia “in vivo”
quale farmaco utilizzare ?
Pseudomonas aeruginosa
Interpretazione
MIC (mg/L)
Ceftazidime
S
4
Imipenem
S
1
Piperacillina
S
32
Ciprofloxacina
R
8
Gentamicina
S
2
Tobramicina
S
1
Amikacina
S
1
Pseudomonas aeruginosa
Piperacillina
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Ceftazidime
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Cefepime
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Imipenem
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Meropenem
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Aztreonam
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Gentamicina
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Tobramicina
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Amikacina
Ciprofloxacina
0.5 | 1| 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
Levofloxacina
0.5 | 1 | 2 | 4 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
Pseudomonas aeruginosa
MIC (mg/L)
Interpretazione
Range MIC=
S
Ceftazidime
4
S
<1-8
Imipenem
1
S
< 0.5 - 4
Piperacillina
32
S
< 0.5 - 64
Ciprofloxacina
8
R
< 0.25 - 4
Gentamicina
2
S
< 0.5 - 4
Tobramicina
1
S
< 0.5 - 4
Amikacina
1
S
< 0.5 - 16
Trend % I/R Escherichia coli 2009-ott.2010
Tutti Materiali ND
ESBL
Trend % I/R P.aeruginosa 2009-ott.2010
Tutti Materiali ND
Trend % I/R Klebsiella pneumoniae 2009-ott.2010
Tutti Materiali ND
Produzione di ESBL (CTX-M-15)
+
 OMP K36
2007-2008: Klebsiella pneumoniae
da vari ospedali
Ampicillina
> 16
Amoxi/Clav
> 16
Pip/Tazo
> 64
Cefotaxime
> 16
Ceftazidime
> 32
Cefepime
> 16
Aztreonam
> 16
Imipenem
1-2
Meropenem
2-4
Ertapenem
>8
Tigeciclina
1-2
Colistina
<1
Isolato
produttore di ESBL
D’Andrea et al., 19th ECCMID
ERT
MEM
Amikacina
Gentamicina
Tobramicina
TMP/SXT
Ciprofloxacina
Levofloxacina
IMI
> 32
> 8
> 8
> 2
> 32
> 32
Diffusione clonale
Resistenza emergente ai carbapenemi nelle
Enterobacteriaceae
ESBL o
produzione di AmpC
+
perdita di porine
Produzione di
metallo-b-lattamasi
(VIM, IMP)
89 Klebsiella spp.
59 Enterobacter spp.
(isolati non sensibili ai carbapenemi)
Woodford et al., JAC 2007; 50:582
Klebsiella pneumoniae
resistente ai carbapenemi
EARSS 2008
Produzione di
carbapenemasi a
serina
(KPC, SME, IMI)
METALLO-BETA-LATTAMASI: UN PROBLEMA GLOBALE
IMP-1 a 23 P. aeruginosa, Acinetobacter, altri GNNF, Enterobacteriaceae
VIM-1 a 18 P. aeruginosa, Acinetobacter, altri GNNF, Enterobacteriaceae
SPM-1
GIM-1
AIM-1
SIM-1
KHM-1
P. aeruginosa
P. aeruginosa
P. aeruginosa
Acinetobacter
Citrobacter freundii
EMERGENZA DI KLEBSIELLA PNEUMONIAE PRODUTTORE DI KPC IN ITALIA
Gioconda Brigante1, Silvia Bracco1, Marco Maria D’Andrea2, Tommaso Giani2, Nicoletta Corbo1,
Mario Tavola3, Gian Maria Rossolini2, Francesco Luzzaro1
1Laboratorio
di Microbiologia e Virologia, Ospedale A. Manzoni, Lecco
di Biologia Molecolare, Sezione di Microbiologia, Università di Siena
3Unità di Terapia Intensiva, Ospedale A. Manzoni, Lecco
2Dipartimento
AMCLI 2009
Tra maggio e giugno 2009, Klebsiella pneumoniae produttore di KPC-2 è stata
riscontrata in 3 pazienti ricoverati presso la Terapia Intensiva dell’Ospedale A.
Manzoni (Lecco). Gli isolati erano caratterizzati da resistenza ad alto livello verso
cefalosporine, fluorochinoloni e piperacillina-tazobactam, mentre gentamicina (MIC, 2
mg/L), tigeciclina (MIC, 2 mg/L) e colistina (MIC, 0.5 mg/L) mantenevano la loro
attività. Per quanto riguarda i carbapenemi, gli isolati presentavano MIC elevate (> 1
mg/L) per tutte le molecole testate (ertapenem, imipenem e meropenem) e test di
Hodge positivo, indicando la possibile produzione di carbapenemasi. La presenza di
enzimi di tipo KPC è stata sospettata sulla base dei risultati dei test di conferma
fenotipici (test di sinergia con EDTA negativo, test di inibizione con acido boronico
positivo) e definitivamente confermata mediante sequenziamento genico.
Suggested action plan for rapid implementation of infection control
measures in settings with sporadic occurrence or complete absence
of carbapenemase-producing Gram-negatives
NDM-1: una nuova MBL negli enterobatteri
Emergenza e rapida diffusione di E. coli
produttore di carbapenemasi NDM-1
NDM-1
Resistenza multipla agli antibiotici in Escherichia coli
produttore di carbapenemasi NDM-1
Trend % I/R Acinetobacter baumanni MDR 2009-ott.2010
Tutti Materiali ND
In diminuzione i casi di Acinetobacter baumanni MDR
Trend % I/R Enterobacteriaceae (escluso E.coli) 2009ott.2010 Tutti Materiali ND
Differenze CLSI – EUCAST
CARBAPENEMI e Enterobacteriaceae
Breakpoints EUCAST più bassi rispetto al CLSI
CLSI 2010
EUCAST 2010
S ≤
I
R ≥
S ≤
I
R ≥
Doripenem
-
-
-
1
2-4
8
Ertapenem
2
4
8
0.5
1
2
Imipenem
4
8
16
2
4-8
16
Meropenem
4
8
16
2
4-8
16
Emocolture 2010 (1)
Emocolture 2010 (2)
Clone circolante di P.aerugionosa R ai carbapenemi
% I/R per Reparti
Caratteristiche Cliniche delle ESBL

Anche quando sensibili in vitro alle Cefalosporine di
quarta generazione, si hanno fallimenti terapeutici
in clinica

Generano difficoltà cliniche a causa della
resistenza crociata con altre classi di antibiotici
(p.es. Aminoglicosidi)

Sono associate ad epidemie ospedaliere
caratterizzate da alte morbidità e mortalità

Determinano un sovrautilizzo di altri antibiotici ad
ampio spettro
…. riepilogando
:
ESBL
AmpC
inducibile
AmpC
plasmidica
Plasmidica
Cromosomica
Plasmidica
Più spesso trovata in
E. coli
Klebsiella spp.
P.mirabilis
altre
Enterobacter
C. freundii
S. marcescens
M. morganii
Providencia spp.
Proteus rettgeri
E. coli
Klebsiella spp.
Inibizione da Acido
clavulanico
SI
NO
NO
Cefoxitina - Cefotetan
S
R
R
Test fenotipici
A volte
No
?
Refertazione
Refertare tutte le
Cefalosporine, Penicilline e
Aztreonam come resistenti
Aggiungere commento
?
Posizione dei geni di
resistenza
β-lattamasi di tipo AmpC
costitutiva
E. coli
Shigella
P.mirabilis
inducibile
(transitoria)
Enterobacter
C. Freundii
M. Morganii
Providencia
Serratia
P.aeruginosa
a basso livello
ad alto livello
(ceppi iperproduttori)
cromosomica
plasmidica
E. coli
Klebsiella
derepressa
(stabile)
Problematiche Cliniche della b-lattamasi
AmpC



Alcune molecole ( aminocilline, cef. 1°g, a.clav.) sono
forti induttori
Altre ( cef. 3°g., ureidopenicilline ) sono deboli induttori
ma possono selezionare mutanti derepressi
La produzione di enzima indotta o costitutiva può
causare fallimenti terapeutici
b -lattamasi AmpC derepressa

Le Cefalosporine selezionano mutanti
derepressi da popolazioni inducibile

Selezione si ha in circa il 20% delle
batteriemia da Enterobacter

molti isolati di Enterobacter e di C. freundii
sono oggi derepressi al primo isolamento
Screening e conferma della produzione di ESBL nelle
Enterobacteriaceae
CEFTAZIDIMEa
e/o
CEFOTAXIME
MIC  2 mg/L
NO
ESBL –
SI
colib
Escherichia
Proteus mirabilis
Klebsiella oxytoca
Klebsiella pneumoniae
Screening positivo
per la produzione di
ESBL
Test di conferma
per la produzione
di ESBL
Microbiologia Medica 2007; 22:281-290
Specie che producono b-lattamasi
cromosomiche di classe C
(per esempio, Enterobacter spp.,
Citrobacter freundii, Serratia
marcescens, Morganella morganii,
Providencia spp. )
Test di conferma
per la produzione
di ESBL
BETA-LATTAMICI ed
Enterobacteriaceae
CLSI 2009
Regola esperta:
in presenza di ESBL,
refertare tutte le
penicilline, le
cefalosporine e
l’aztreonam
RESISTENTI
Beta-lattamici ed Enterobacteriaceae
Differenze tra criteri interpretativi
secondo EUCAST e CLSI
CLSI 2010
EUCAST 2010
S ≤
I
R ≥
S ≤
I
R ≥
Cefepime
8
16
32
1
2-4
8
Cefotaxime
1
2
4
1
2
4
Ceftazidime
4
8
16
1
2-4
8
Ceftriaxone
1
2
4
1
2
4
Aztreonam
4
8
16
1
2-4
8
=
=














S E R V I Z I O DI M I C R O B I O L O G I A E V I R O L O G I A
** LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA **
DIRETTORE DOTT. FABIO RUMPIANESI
SIG. C
UROLOGIA/156
A
nato il :30/07/1951
prenotato il 17/11/2010 n. 459
prelievo del 17/11/2010 alle 18:06
Descrizione
Esito
---------------------------------------------------------------------------MICROBIOLOGIA
Materiale: SANGUE
Colturale batteri,miceti aerob.
Automazione Bactec
POSITIVO
Microscopico da fl.Bactec aerobio Bacilli Gram-Negativi





























Colturale batteri anaerobiosi
Automazione Bactec
POSITIVO
Microscopico da fl.Bactec anaerob Bacilli Gram-Negativi
Identificazione 1 anaerobiosi
Klebsiella pneumoniae ssp pneumonia
Antibiogramma 1 anaerobiosi
Klebsiella pneumoniae ssp pneumonia
Antibiogramma definitivo:
la determinazione delle
MIC per piperacillina/tazobactam,
imipenem e meropenem sono state eseguite
con metodo E-TEST.
- range sensibilità M.I.C. Amikacina
4
S
<= 16
Amoxicillina/A.CLAV.
>=32
R
<= 8
Ampicillina
>=32
R
<= 8
Cefazolina
>=128
R
<= 8
Cefepime
>=64
R
<= 8
Cefotaxime
>=64
R
<= 8
Ceftazidime
>=64
R
<= 8
ESBL
POS
+
Gentamicina
>=16
R
<= 4
Imipenem
0,25
S
<= 4
Levofloxacin
>=8
R
<= 2
Meropenem
1,5
S
<= 1
Norfloxacina
>=16
R
<= 4
Piperacillina
>=128
R
<= 16
Piperacillina/tazobactam
>=256
R
<= 128
Trimetoprim/Sulfam.
>=320
R
<= 40
Tygeciclina
2
S
<=0,012
=>256