Transcript Презентация - Pharmavam.ru

ПЛЕНАРНОЕ ЗАСЕДАНИЕ
«БИОТЕХНОЛОГИИ БУДУЩЕГО ВО ФТИЗИАТРИИ»
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ
ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЁЗА:
ПОИСК ВОЗМОЖНОСТЕЙ
Г.С. БАЛАСАНЯНЦ
Химиопрепараты,
антибиотики
Превентивное
лечение
Этиотропное
лечение
Лечение
туберкулеза
Симптоматическое
лечение
Другие лекарственные
средства с
антимикробной
активностью
Патогенетическое
лечение
Новые химиопрепараты
Исходные химические
производные
Rifapentine
Дериват рифампицина
Moxifloxacin
Фторхинолон третьего
поколения
Clofazimine
Жирорастворимый
риминофеназин
БЕДАКВИЛИН
диарилхинолон
Nitromidazopyrans:
Дериваты метронидазола
Nitromidazo-oxazine PA-824
Delamanid OPC-67683
Oxazolidinones
Linezolid
Родственник
циклосерина
PNU-100480, Sutezolid
AZD-5847, Posizolid
1,2 этилендиамин этамбутола
SQ 109
Benzothiazinones
BTZ043
антибиотик
Dinitrobenzamides
DNB1, DNB2
антибиотик
В последние годы все больше
обращается внимание на поиск новых
веществ
с
антимикробным
потенциалом, лишенных недостатков
традиционных антибиотиков.
В этом плане сегодня высок интерес к
использованию
пробиотических
бактерий,
бактериофагов
и
бактериоцинов
 Пробиотики - молочнокислые бактерии, бифидобактерии, дрожжи, кишечная палочка и
стрептококки рассматриваются как реальные терапевтические средства, которые способные
избирательно контролировать микроорганизмы, поступающие в наш организм. Наиболее известная
антимикробная активность пробиотиков реализуется за счет секреции ряда антибактериальных
веществ неспецифического действия, таких как короткоцепочечные жирные кислоты и перекись
водорода
 Бактериофаги,
в отличие от пробиотиков, являются в высшей степени
специфичными и могут быть активными даже против единичного штамма бактерий. Поэтому,
специально подобранные бактериофаги предлагались как средство против определенных групп
бактерий, обитающих на слизистых поверхностях организма. К недостаткам метода фаготерапии
относят: сложность подбора и размножения бактериофагов, высокая изменчивость бактерий, что
приводит к относительно быстрой потере специфичности фагов, наличие реакции иммунной системы
на лечение фагами и т.д.
 Бактериоцины,
в отличие от классических антибиотиков, синтезируются на
рибосомах и имеют относительно узкий спектр антимикробного действия . По химической природе
это низкомолекулярные белки, разнообразные по размеру, спектру и механизму микробного
поражения, продуцентам и механизмам иммунитета. Значительная часть бактериоцинов
производится грамотрицательными и грамположительными бактериями. Обращает на себя внимание
существование сходного принципа строения бактериальных цитолитических токсинов и белков
врожденного иммунитета
Бактериоцины
— специфические белки, вырабатываемые
некоторыми бактериями и подавляющие жизнедеятельность клеток
других штаммов того же вида или родственных видов бактерий.
Бактериоцины обозначаются в соответствии с видовым названием,
например «Escherichia coli» образует так называемые колицины,
Pasteurella pestis — пестицины. ТУБЕРКУЛОЦИНЫ!!
Механизм действия бактериоцинов связан с повреждением
цитоплазматических мембран, нарушением синтеза ДНК, РНК и
белка.
Спектр активности бактериоцинов в отличие от антибиотиков
узок и определяется наличием рецепторов у бактерий для их
адсорбции.
 Растущий интерес исследователей к классу пороформирующих
пептидов отражает чрезвычайно важную роль этих соединений в
биологических системах.
 Практически все живые существа от вирусов до млекопитающих
(включая человека) синтезируют в своем организме эти соединения и
активно используют их для выживания.
 Особенно следует отметить, что порообразующие белки являются
важным
компонентом
иммунной
системы.
Например,
пороформирующие
цитотоксические
вещества,
продуцируемые
лейкоцитами, перфорины
и дефенсины, являются
эффективной первоначальной защитой от проникновения чужеродных
организмов
Низкомолекулярные катионные пептиды становятся реальными
кандидатами на роль антибиотиков нового поколения (Zasloff, M., 2002)
Антибиотики (antibiotics) [греч. anti — против и bios (biotikos) —
жизнь] — органические вещества микробного, животного или
растительного
происхождения,
а
также
получаемые
синтетическим путем, способные подавлять рост микроорганизмов
или вызывать их гибель, напр., у грибов — пенициллины, у высших
растений — фитонциды , у животных — дефензины .
Дефензины (от англ. defense — защита) — катионные пептиды
иммунной системы, активные в отношении бактерий, грибов и
многих оболочечных и безоболочечных вирусов. Состоят из 18-45
аминокислот, в том числе 6-8 цистеиновых эволюционно
консервативных остатков.
Иммунные клетки используют дефензины для уничтожения
бактерий, поглощённых при фагоцитозе. Обычно дефензины
присоединяются к клеточной мембране микроба и углубляются в неё,
формируя порообразные разрывы.
 Дефензины
обладают мощным провоспалительным действием.
Интратрахеальное введение миелоидных aдефензинов в дозе 5–30 мкг/кг
экспериментальным мышам приводит к быстрому развитию танатогенного
воспалительного процесса в легких. Через пять часов после введения
дефензинов в бронхоальвеолярном лаваже увеличивается количество
нейтрофилов, моноцитов и достоверно повышается концентрация эластазы,
TNFa, CXCL2/MIP2, CCL2/MCP1.
 Провоспалительное действие дефензины реализуют через активацию
TLR, рекрутирование провоспалительных клеток в регион поражения ткани,
возбуждение эпителиоцитов, эндотелиоцитов, дендритных клеток, моноцитов,
макрофагов, нейтрофилов, тучных клеток.
 Различные дефензины в наномолярных концентрациях могут с некоторой
селективностью
рекрутировать
разные
типы
клеток
в
процесс
воспалительного ответа. Так, HNP1, HNP2, HNP3 и HBD1 являются
хемоаттрактантами для моноцитов, а HBD2 — для нейтрофилов, HBD2, HBD3, HBD4 — для макрофагов
 Дефензины непосредственно активируют несколько типов клеток, в
том числе эпителиоциты, кератиноциты, эндотелиоциты, нейтрофилы,
фибробласты, дендритные клетки, тлимфоциты, моноциты, тучные
клетки, функционирование которых приводит к экспрессии и секреции
цитокинов, хемокинов и других биологически активных веществ
 Человеческие
дефензины
имеют
выраженные
свойства
иммуноадъювантов, которые могут усиливать активность гуморального
и клеточного иммунного ответа, направленного против различных
антигенов инфекционных возбудителей, протеинов злокачественных
новообразований
 Jamil Aarbiou и соавт., используя в качестве модели эпителиальные
клетки респираторного тракта линий NCIH292, установили, что HNP при
низких концентрациях (< 10 мкг/мл) ускоряют процесс репарации
поврежденного эпителия.
Абатуров А.Е.
«КАТИОННЫЕ АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ
СИСТЕМЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ
РЕСПИРАТОРНОГО ТРАКТА: ДЕФЕНЗИНЫ И
КАТЕЛИЦИДИНЫ ДЕФЕНЗИНЫ — МОЛЕКУЛЫ,
ПЕРЕЖИВАЮЩИЕ РЕНЕССАНС»
Martineau и соавт. (2007) пришли к заключению, что существенная роль
физиологической реакции нейтрофилов при врожденной устойчивости к
туберкулезной инфекции связана с их способностью продуцировать
катионные антимикробные пептиды (КАП), которые относятся к факторам
естественного иммунитета и способны модулировать цитостатический
эффект макрофагов и нейтрофилов в отношении
Mycobacterium
tuberculosis.
Пептидные фрагменты КАП с преобладающей иммуномодулирующей
активностью получили обозначение– IDR (сокращение от innate defense
regulator) - регуляторы естественного иммунитета
IDR - характеризует отсутствие прямого противомикробного действия,
однако они способны модулировать цитостатический эффект макрофагов
и нейтрофилов в отношении
Mycobacterium tuberculosis. IDR
в
фармакологических решениях рассматриваются
как препараты,
проявляющие
защитный
эффект
без
непосредственного
противомикробного действия
Patricia Mendez-Samperio, Mexico, 2008
Описан прогресс в понимании роли антимикробных пептидов
как потенциальных кандидатов для развития альтернативной
стратегии лечения туберкулеза, особенно в контексте МЛУ ТБ.
•
•
•
•
•
Маленький катионный дефензин (3-5kDa) представляет важную семью пептидов среди
противомикробных пептидов.
β-дефензин HBD-2выделяется эпителием и индуцирует выработку ФНО-α, ИЛ-1 β, в т.ч.
в присутствии МБТ bovis BCG
Основная роль дефензинов – прямой лизис МБТ посредством
разрушения клеточной мембраны. Это происходит за счет
взаимодействия катионного белка – дефензина и анионных
фосфолипидов клетки МБТ, следствием такого взаимодействия
является нарушения клеточного метаболизма
Кроме того, дефензины способны внутриклеточно связывать
полианионные молекулы ДНК. Следствие разрушение МБТ и др.
микроорганизмов
Антимикробная активность дефензинов делает их важными кандидатами для лечения
туберкулеза как непосредственно, так и через процесс хемотаксиса и продукцию
провоспалительных цитокинов, что доказано in vitro и in vivo на мышах.
Bruno Rivas-Santiago, Stephan K. Schwander, Carmen Sarabia, Gill Diamond,4 Marcia E. Klein-Patel,
Rogelio Hernandez-Pando, Jerrold J. Ellner,and Eduardo Sada (2005)
Human -Defensin 2 Is Expressed and Associated with
Mycobacterium tuberculosis during Infection
of Human Alveolar Epithelial Cells
• Определена роль человеческого β-дефензина
2(HBD-2) в развитии туберкулеза. Выделение этого
дефензина определяли для эпителиальных клеток,
альвеолярных макрофагов и моноцитов крови.
• Эпителиальные клетки выделяют HBD-2 при
различных вариантах микобактериозов
• Альвеолярные
макрофаги
только
в
присутствии МБТ
• Моноциты не выделяют HBD-2
• Показано, что альвеолярные макрофаги выделяют
HBD-2 только после прилипания к МБТ
SUDHIR SHARMA, INDU VERMA, AND G. K. KHULLER*
Department of Biochemistry, Postgraduate Institute of Medical
Education & Research, Chandigarh, India
Therapeutic Potential of Human Neutrophil Peptide 1
against Experimental Tuberculosis
• Антимикробные пептиды- альтернатива антибиотикам
вследствие их антимикробной активности
• Дефензины - семья маленьких пептидов с шестью
цистеиновыми аминокислотами
• HNP-1 in vitro и in vivo обнаружил антимикробную
активность против различных микроорганизмов, включая
МБТ
• HNP-1обладает свойством хемотаксиса по отношению к
Т-лимфоцитам и моноцитам и продуцирует ИЛ-8
Изучение АМП с многообещающим будущим в качестве
биотехнологических инструментов представляет особую значимость
для создания новых лекарств из «естественных антибиотиков»
Андреева-Ковалевская Ж.И. и соавт.,2008, Marshall S. H., Arenas G., 2003, Nes IF, Yoon S-S & Diep
DB., 2007
Первые шаги в этом направлении уже сделаны. Для лечения хронических инфекций
и злокачественных новообразований в Украине в последние годы применяется
препарат Пропес, который содержит биологически активные регуляторные пептиды –
альфа- и бета-дефензины, полученные путем контролируемого протеолиза из
эмбриональной ткани животных.
Накопленный опыт свидетельствует о способности Пропеса индуцировать антигенспецифичный иммунный ответ в отношении возбудителей хронических
нейроинфекций. Пропес продемонстрировал способность улучшать эффективность
комплексной терапии и увеличивать продолжительность жизни онкологических
больных
Глутоксим - один из первых, разрешенных к
клиническому применению в России синтетических
препаратов, отнесенных в
группу
IDR.
[Easton D.M., Nijnik A.,].
ГЛУТАТИОНОВАЯ СИСТЕМА ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО РЕДОКС КОНТРОЛЯ В НОРМЕ
Редокс чувствительный
клеточный сигналинг
GSH
Глутатиониляция
белков
Активация/ингибирован
ие
SH-содержащих белков/энзимов
Модулирование сигнального
пути
Изменение уровней
цитокинов, регуляторов
клеточного цикла и т.п.
Клеточная
детоксикация
Восстановленный глутатион
GSSG
Окисленный глутатион
Инактивация свободных радикалов и
активных форм кислорода
Связывание токсинов для активного
удаления из клетки
•Регуляция метаболизма рецепторов,
биорегуляторов, ионных каналов ,
транспортных белков и т.д, в том числе
•метаболическая активность гепатоцитов
•стимуляция гемопоэза
Danyelle M. Townsend1, Larry K. Keefer2, Joseph E. Saavedra3, Christopher J. Pazoles4 and Kenneth D. Tew5
ГЛУТОКСИМ УВЕЛИЧИВАЕТ КОЛИЧЕСТВО ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ НА
КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ЗА СЧЕТ ИНГИБИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ
БЕЛКА ДИСУЛЬФИД ИЗОМЕРАЗЫ (БДИ)
Относительная
интенсивность
-SH
GSSG восприимчив
ая поверхность
тиолов
Контроль
Глутоксим
S-S
Оценивалось на HL-60 cells +/- 300 µM
Глутоксим; маркировано флуоресцентным
N-этил малеимидом
Глутоксим
* p<0.05
Townsend D. M. et al. NOV-002, a Glutathione Disulfide Mimetic, Is a
Pleiotropic Modulator of Cellular Redox Balance //Cancer Res 2008; 68:
(8). April 15, 2008 P.2870-77
•
•
В ЦНИИТ РАМН была выполнена работа по изучению способности
препарата ГЛУТОКСИМ модулировать цитостатический эффект макрофагов
и нейтрофилов чувствительных и резистентных к туберкулезу мышей в
отношении Mycobacterium tuberculosis.
В экспериментах использованы макрофаги и нейтрофилы, выращенные из
костного мозга, полученного от инбредных линий мышей - I/StSnEgYCit (I/St)
и C57BL/6 (B6)
Были изучены следующие комбинации:
1. M. tuberculosis per se;
2. M. tuberculosis + Глутоксим;
3. M. tuberculosis + макрофаги;
4. M. tuberculosis + макрофаги + Глутоксим;
5. M. tuberculosis+ нейтрофилы;
6. M. tuberculosis + нейтрофилы +Глутоксим;
7. M. tuberculosis + макрофаги + нейтрофилы;
8. M. tuberculosis + макрофаги + нейтрофилы + Глутоксим.
Подобные комбинации были использованы в отношении клеток обеих линий
Влияние Глутоксима на антимикобактериальную
активность нейтрофилов
4500
4000
3500
СРМ
3000
B6
2500
I/St
2000
Rv only
1500
1000
500
0
500
250
125
62,5
31
16
8
4
0
концентрация Глутоксима (мкг/мл)
 культивируемые в условиях in vitro ПНф сами по себе не способны
подавлять метаболическую активность МБТ, и добавление в систему
ГЛУТОКСИМА эту ситуацию изменить не способно.
Влияние Глутоксима на антимикобактериальную
активность комбинации КММф+ПНф
3500
3000
СРМ
2500
B6
2000
I/St
1500
Rv only
1000
500
0
500
250
125
62,5
31
16
8
4
0
концентрация Глутоксима (мкг/мл)
 В отличие от предыдущих результатов, комбинация КММф и ПНф существенно
подавляет включение метки микобактериями по сравнению с контролем
(МБТ без клеток – зеленый треугольник)
Добавление ГЛУТОКСИМА в возрастающих дозах заметно не увеличивает
антимикобактериальную активность данной комбинации
 ГЛУТОКСИМ не влияет на пролиферацию МБТ в отсутствии в культуре
клеточных элементов (синяя кривая)
 Добавление ГЛУТОКСИМА в систему МБТ + КММф дозозависимо усиливает
антимикобактериальный эффект макрофагов обеих линий мышей,
причем потенцирующее действие лекарства более выражено в отношении
КММф мышей, чувствительной к туберкулезу линии I/St (зеленая кривая)
 Антибактериальный эффект ГЛУТОКСИМА в культуре КММф связан с его
способностью препятствовать гибели зараженных МТБ КММф в культуре.
 Более высокая выживаемость макрофагов в этих условиях обеспечивает более
выраженную и продолжительную их активность в отношении МТБ.
 Об этом свидетельствует пониженный выход ЛДГ из клеток в присутствии
ГЛУТОКСИМА, т.к. выход лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из клеток - мера клеточного
лизиса
Механизм действия
Стимуляция Са2+-зависимого везикулярного экзоцитоза микобактерий из
макрофагов
Восстановление
функциональной
макрофагов через увеличение [Ca2+]
активности
инфицированных
Механизм действия
Стимуляция конвертации неактивного изониазида в активную
изоникотиновую кислоту независимо от каталазы пероксидазы
Результаты фармакологических исследований in vitro
Штамм МБТ H37Rv
(чувствительный к изониазиду)
Штамм клинического изолята
МБТ №2712 (резистентный к
изониазиду):
Генотип: katG (Ser315->Thr(1)),
katG (IIe335->Va),ahpC_T10
Результаты фармакологических исследований in vitro
Штамм клинического изолята
МБТ №5307 (резистентный к
изониазиду):
Генотип: мутация в гене inhA
Штамм клинического изолята
МБТ №5227 (резистентный к
изониазиду):
Генотип: katG (Ser315->Thr(1)),
ahpC_A10
Результаты фармакологических исследований in vivo
Животная модель туберкулеза (мыши)
Штамм М. tuberculosis Erdman, чувствительный к изониазиду. Терапия
проводилась 10 мг/кг изониазида или 10 мг/кг V-007 в течение 6 недель со дня
регистрации очагов туберкулезного воспаления
Результаты фармакологических исследований in vivo
P<0.05, параметрический тест Стьюдента – Фишера и
непараметрический критерий U Уилкоксона-Манна-Уитни
Результаты фармакологических исследований in vivo
Клинический изолят штамма М. tuberculosis №9660, резистентный к зониазиду.
Терапия проводилась 10 мг/кг изониазида или 10 мг/кг V-007 в течение 6 недель со
дня 1111регистрации очагов туберкулезного воспаления
ИНСТРУКЦИЯ
по медицинскому применению препарата
ГЛУТОКСИМ
Регистрационный номер Р N002010/01
(GLUTOXIM)
Торговое название препарата: Глутоксим.
Международное непатентованное название или группировочное название: Глутамил-Цистеинил-Глицин динатрия&.
Химическое название: бис-(гамма-L-глутамил)-L-цистеинил-бис-глицин динатриевая соль.
Лекарственная форма: раствор для инъекций.
Состав: Активное вещество: Глутамил-Цистеинил-Глицин динатрия 5 мг, 10 мг или 30 мг в 1мл. Вспомогательные вещества: натрия ацетат,
кислота уксусная разведенная, вода для инъекций.
Описание: Прозрачная бесцветная или слабо окрашенная жидкость без запаха или со слабым запахом уксусной кислоты.
Фармакотерапевтическая группа: иммуностимулирующее средство.
Код АТХ [L03АХ]
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ
Фармакодинамика
……Глутоксим® оказывает прямое ингибирующее действие на активность фактора множественной лекарственной устойчивости
опухолевых клеток - белок Р-гликопротеин (Рgp), который определяет устойчивость опухолевых клеток к действию средств химиотерапии,
включая антрациклиновые антибиотики, препараты алкилирующего действия.
Глутоксим® инициирует реакцию трансформации изониазида – пролекарство, в фармакологически активную форму –
изоникотиновую кислоту, обладающую бактериостатическим действием на Micobacterium tuberculosis, что позволяет преодолеть
лекарственную резистентность Micobacterium tuberculosis, обусловленную негативной трансформацией генов katG
(ген
каталазы-пероксидазы) и inhA (ген енол-АПБ-редуктазы).
Глутоксим® стимулирует процессы экзоцитоза везикул из макрофагов с внутриклеточно паразитирующими микроорганизмами,
включая Micobacterium tuberculosis, обеспечивая их удаление из фармакологического убежища и делая доступными для
действия антибактериальных препаратов, включая изониазид, рифампицин, рифабутин, циклосерин, капреомицин,
левофлоксацин.
Глутоксим® усиливает секрецию катионных пептидов – дефенсинов и каталецидинов макрофагами, стимулирует их поглощение
микобактериями туберкулеза, определяя опосредованное антибактериальное действие препарата.
ТАК,
ВСЕ-ТАКИ,
ПРОИЗОЙДЕТ
ЛИ
В
БЛИЖАЙШИЕ ГОДЫ «БАКТЕРИОЦИНОВАЯ»
РЕВОЛЮЦИЯ?
Движущими силами ее наступления являются:
 необходимость в снижении удельного веса применения
антибиотиков,
чтобы
приостановить
стремительное
распространение резистентных к ним форм бактерий,
 научно доказанная возможность создания нового класса
антимикробных средств, лишенных недостатка традиционных
антибиотиков,
 энтузиазм исследователей, направленный на разработку
лекарственных средств класса природных антибиотиков.
Благодарю
за внимание!
Баласанянц Г.С.