Transcript Gene x
Gain de fonction, perte de fonction Discovery-driven research Comparaison ARNm de cellules à division rapide Vs ARNm de cellules à division lente gène x = candidat hypothesis-driven research Ce gène active la division cellulaire Puce à ADN Gain de fonction Sur-expression 24 h après expression physiologique Produit de gène x Sous-expression Perte de fonction Gain de fonction Organisme Cellule perte de fonction Transgénique Knock Out sur-expression sous-expression Approche : Gain de fonction Produit de gene x = protéine x expression physiologique protéine x ARNm codant protéine x ADN codant protéine x Sur-expression macromolécule informationnelle ADN codant protéine x transcription ARNm codant protéine x traduction protéine x ? - Source de la macromolécule informationnelle ? - Introduction dans la cellule Source de la macromolécule informationnelle ADN PCR, Clonage ARN Transcription in vitro Protéine Protéine recombinante Purifiée à partir d’une source biologique Transcription in vitro Promoteur d’ARN polymérase de bactériophage ADN codant protéine x Plasmide recombinant Transcription in vitro ARN polymérase de bactériophage Plasmide recombinant ARN Protéine recombinante Promoteur bactérien ADN codant protéine x Transfection Plasmide recombinant Extraction et purification Escherichia coli Protéine x Introduction dans la cellule * Transfection * Transformation * Transduction Transfert de matériel génétique exogène dans une cellule. Acquisition par un organisme de caractères héréditaires nouveaux après pénétration dans ses cellules de matériel génétique exogène. Transfert de matériel génétique d'une bactérie à une autre ou d'une cellule à une autre par l'intermédiaire d'un virus. La membrane plasmique est une barrière physique à la transfection de protéines et acides nucléiques Paroi bactérien (gram -) Porine (protéine) lipoprotéine Membrane Plasmique extérieur Lipopolysaccharides Périplasme Membrane Plasmique intérieur peptidoglycan peptidoglycan Transporteur (protéine) Paroi de lévure Paroi d’une cellule végétale Paroi pectocellulosique Membrane plasmique Production de protoplastes protoplaste Cellule végétale Digestion enzymatique Production de sphéroplastes sphéroplaste levure Digestion enzymatique Comment faire pénétrer une macromolécule Informationelle à l’intérieure d’une cellule ? Micro-rupture de la membrane plasmique Endocytose Fusion membranaire - Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc - Endocytose - Fusion membranaire Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - artificielle - biologique - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc Micro-injection : artificielle Micro-injection : artificielle Avantages : transfection très efficace Inconvénients : lourdeur technique transfection de populations de cellules impossible Micro-injection : biologique : bactéries T 7 Bactériophage T7 M13 Pilus F Bactériophage M13 Micro-injection : biologique : cellules végétales galles Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium : cycle de vie Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc Choc-osmotique/choc-thermique CaCl2 LiCH3CO2 Ca++ Li+ levure bactérie Cl- CH3CO2H2O turgescence 37°C turgescence 42°C ADN perméabilisation perméabilisation Choc-osmotique/choc-thermique Avantage : Peu onéreuse transfection de populations de cellules Inconvenients : faible efficacité toxicité échanges non-spécifiques d’autres molécules Micro-rupture de la membrane plasmique - Micro-injection - Choc-osmotique/choc-thermique - éléctroporation - Biolistique - Onde de choc Electroporation - 10 - 100 kV/cm 10 - 1000 s + + + + + + + Electroporation résistance alimentation Interrupteur # 1 capacitance Interrupteur # 2 Electroporation Avantage : efficacité de transfection transfection de populations de cellules Inconvenients : toxicité échanges non-spécifiques d’autres molécules Biolistique microbilles en or hélium hélium Rupture de la membrane calibrée …… …… Capsule à microbilles Onde de choc Grille de rétention .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. cellules transfectées Biolistique Biolistique Avantage : Utilisation avec cellules à paroi transfection de populations de cellules Inconvenients : Endommage les cellules Transfection peu uniforme Nanosecond pulsed laser-induced stress wave Nanosecond pulsed laser-induced stress wave Avantage : ? Technique trop récente Inconvenients : ? Agrolistique Comment faire pénétrer une macromolécule Informationelle à l’intérieure d’une cellule ? Micro-rupture de la membrane plasmique Endocytose Fusion membranaire Endocytose L’endocytose implique la capture spécifique de macromolécules ou nanoparticules par la membrane plasmique Endocytose Macromolécules cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus Endocytose Macromolécules cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus Endocytose : -de la protéine antennapaedia Peptides cationiques RQIKIWFQNRRMKWKK + + + + + ++ -de la protéine tat de VIH GRKKRRQRRRPPQC ++ + ++ + ++ - oligo arginine RRRRRRRRR + ++ + ++ ++ + Peptides passe-membranes (cell-penetrating peptides : CPP) CPP (conjugaison chimique) conjugaison chimique (liaison covalente) GRKKRRQRRRPPQC CPP (peptide de synthèse) cargo Protéine ARN ADN CPP (protéine de fusion recombinante) ADN codant CPP Plasmide recombinant ADN codant protéine x Transfection dans E.coli RQIKIWFQNRRMKWKK- Protéine x Endocytose Macromolécules cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus Endocytose : Phosphate de calcium 3 CaCl2 + 2 Na3PO4 Membrane plasmique Ca3PO4 + 6NaCl + + - + - - + + - + - - + + + + nanoparticules - + - - endosome ADN ARN Protéine ? + + Précipitée Ca3PO4 / ADN nanoparticulaire Endocytose Macromolécules cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus Endocytose : Polymères ramifiés + ADN ARN Protéine ? + + + + + + + Polyéthylénimine (PEI) Complexe PEI / ADN nanoparticulaire Endocytose Macromolécules cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus Endocytose : lipides amphipathiques + + + + + + + + + région cationique région lipidique (hydrophobe) + + + + + Lipoplexe (nanoparticule) example : L-dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE) Endocytose Macromolécules cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus Endocytose : peptides amphipathiques O C O O C N O région hydrophobe région cationique KETWWETWWTEWSQPKKKRKVC p p p +- p - p + ++++ Pep-1 p Endocytose : peptides amphipathiques +++++ +++++ +++++ Nanoparticule de Pep-1/cargo (protéine) Endocytose Macromolécules cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus Endocytose : nanoparticules hydrophobes ADN ARN Protéine Lipofection Endocytose Macromolécules cationiques - peptides cationiques Nanoparticules - cationiques - phosphate de calcium - polymères ramifiés - molécules amphipathiques - lipides - peptides - hydrophobes - liposomes - ligands membranaires - virus Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus virus recepteur membranaire virus Les virus Génome db ADN sb sb+ Famille Poxviridae Herpesviridae Adenoviridae Parvoviridae Coronaviridae Retroviridae Picornaviridae ARN sb- Rhabdoviridae Filoviridae Réoviridae Les virus Génome db ADN sb sb+ Famille Poxviridae Herpesviridae Adenoviridae Parvoviridae Coronaviridae Retroviridae Picornaviridae ARN sb- Rhabdoviridae Filoviridae Réoviridae Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus Adenoviridae Ligands de protéines membranaires : Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus Adenoviridae Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus Adenoviridae Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus Adenoviridae E1 déleté = réplication incompétente Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus Adenoviridae transgène promoteur E1 genome avec transgène transfection plasmide Cellules transformées par E1 réplication incompétente transgènique virus Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus Adenoviridae Avantages : transduction très efficace grande tropisme Inconvénients : Expression transitoire Sécurité Les virus Génome db ADN sb sb+ Famille Poxviridae Herpesviridae Adenoviridae Parvoviridae Coronaviridae Retroviridae Picornaviridae ARN sb- Rhabdoviridae Filoviridae Réoviridae Retroviridae Genres : * Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus Retroviridae Genres : * Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus retroviridae Avantages : transduction très efficace Expression stable (intégration) Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose faible tropisme sécurité Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus retroviridae Avantages : transduction très efficace Expression stable (intégration) Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose faible tropisme sécurité Retroviridae Genres : * Alpharetrovirus * Betaretrovirus * Gammaretrovirus * Deltaretrovirus * Epsilonretrovirus * Lentivirus * Spumavirus Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus retroviridae Avantages : transduction très efficace Expression stable (intégration) Inconvénients : Intégration uniquement lors de la mitose faible tropisme sécurité Endocytose : nanoparticules : ligands membranaires : virus retroviridae rétrovirus : défective pour la réplication env LTR LTR Plasmide Plasmide transfection gag/pol Plasmide Cellule productrice 3’ LTR inactive promoteur transgene U3 U3 R U5 R U5 Recombinaison pendant transcription inverse promoteur transgene U3 R U5 5’ LTR auto-inactivé U3 R U5 Comment savoir si les cellules transfectées/transduites expriment la protéine x - anticorps spécifique - western blot - immunofluorescence - anticorps contre étiquette (epitope tag) - western blot - immunofluorescence - protéine de fusion (fluorescente) Comment savoir si les cellules transfectées/transduites expriment la protéine x - anticorps spécifique - western blot - immunofluorescence - anticorps contre étiquette (epitope tag) - western blot - immunofluorescence - protéine de fusion (fluorescente) étiquetage (epitope tagging) promoteur HIS HHHHHH c-MYC EQKLISEEDL HA YPYDVPDYA VSV-G YTDIEMNRLGK ADN codant étiquette ADN codant Protéine x Plasmide HSV QPELAPEDPED V5 GKPIPNPLLGLDST FLAG DYKDDDDK Comment savoir si les cellules transfectées/transduites expriment la protéine x - anticorps spécifique - western blot - immunofluorescence - anticorps contre étiquette (epitope tag) - western blot - immunofluorescence - protéine de fusion (fluorescente) Etiquetage Green Fluorescent Protéine (GFP) dsRED Co-marquage co-transfection co-traduction (IRES) Pcmv his6 mTrim17 his6 YFP ires YFP SV40 polyA expression transitoire ou expression stable expression transitoire expression stable Nécessite une intégration génomique rétrovirus intégration fortuite Événement rare sélection ADN x promoteur 1 polyA Gene de résistance antibiotique promoteur 2 polyA expression inductible P CMV tTA-NLS doxycycline Tet repressor/TA tetO tetO tetO tetO tetO tetO P CMVmin Gene x SV40 polyA expression inductible P CMV rtTA-NLS doxycycline Reverse Tet repressor/TA tetO tetO tetO tetO tetO tetO P CMVmin Gene x SV40 polyA