Transcript Historia de la interferencia del RNA (RNAi)

RNA INTERFERENCE: THE STORY OF GENE
SILENCING IN PLANTS AND HUMANS
Manhood-ur-Rahman, Imran Ali, Tayyab Husnain, Sheikh
Riazuddin
National Center of Excellence in Molecular Biology (CEMB), 87-West
Canal Bank Road, University of the Punjab, Lahore-53700, Pakistan
Historia de la interferencia del RNA
(RNAi)
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Descubierto accidentalmente cuando se inyecto una cadena anti-sentido para
bloquear la expresión de el gen par-I en Caenorhabditis elegans.
RNA antisentido
RNA sentido
Sin inyectar
Reducción de la
expresión
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Guo S, Kemphues KJ. Par-1 a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative
Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 1995;81:611–20
Historia de la interferencia del
RNA (RNAi)
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Años atrás, biólogos experimentaron en petunias con la introducción de gen
productor de pigmentos bajo el control de un promotor; para tener flores de
color purpuro oscuro.
Variegacion
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Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in
reversible co-suppression of homologous genes intrans. Plant Cell 1990;2(4):279–89.
Historia de la interferencia del
RNA (RNAi)
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En 1998, Fire y Mello finalmente resolvieron el misterio al inyectar un
RNA de doble cadena dentro de C. elegans.
Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans. Narture 1998;391:806–11.
Mecanismo de la interferencia del
RNA
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dsRNA
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DICER
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siRNA (21-24N)
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AGO2
FMRP
P100
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RISC
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mRNA
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Mecanismo de la interferencia del
RNA
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Posibles propósitos en la
célula:
 Inhibir la movilización de
transposones.
 Actuar como mecanismo de
antiviral en plantas.
Silenciamiento de virus en plantas
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Mecanismos contra las moléculas de RNA (virales) que pueden causar el
silenciamiento de genes:
RNA pol. dependiente de RNA implicado en la conversión de ssRNAs en
dsRNAs, para su procesamiento por Dicer para generar siRNAs.
EL Silenciamiento de RNA en las plantas participan dos especies de siRNA
funcionalmente distintas:
 siRNAs 21N: La escisión de los transcripto blanco mediada por RISC,
involucrados en la señalización a corta distancia.
 siRNAs 25 N: metilación del ADN y la propagación sistémica del
silenciamiento.
Silenciamiento de virus en plantas
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Las vías de silenciamiento endógeno participan en la regulación génica en a
nivel de transcripción, a estabilidad de RNA y el los niveles en la traducción.
La maquinaria de RNAi responde a una variedad de elementos que lo
activan, incluyendo la infección viral, los transgenes, elementos repetidos y
transposones.
Durante una infección de virus:


Acumulación de siRNAs 21N de doble cadena en tejidos locales y sistémicos.
Reducción del título viral, y en algunos casos, la inmunidad o la recuperación en
hojas superiores no inoculados.
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Varios virus de plantas han desarrollado resistencia contra siRNA y
desarrollaron proteínas que suprimen diversos pasos del mecanismo de
silenciamiento .
P19 es un dímero de reconocimiento, une los extremos del dúplex de siRNA,
interrumpiendo el mecanismo de silenciamiento.
La interferencia de RNA y PTGS en las plantas han sido propuesto para
ser un fenómeno relacionado en la protección del genoma del organismo
contra extranjeros ácidos nucleicos.
dsRNA
Silenciamiento del virus de Hepatitis C
(HCV)
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El Virus la hepatitis C (VHC) tiene un genoma único ssRNA el cual funciona
tanto como un mRNA y de cadena de referencia.
Seidentificó siRNAS (60N) en Saccharomyces cerevisiae, que inhibe la región
no traducida 5’ (5’UTR).
RNAi es un factor limitante para la infección por el VHC, y además que
algunas proteína nucleares suprimen el silenciamiento de RNA basados en
la respuesta antiviral.
RNAi dirigida a IRES (Internal Ribosome Entry Site) muestra un fuerte efecto
inhibidor sobre la expresión del gen bajo el control de esta secuencia.
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La interferencia de RNA bloquea la expresión génica y la síntesis de RNA de
replicones VHC de la hepatitis C se propaga en replicones humanos las
células del hígado.
Dos siRNAs en introducidos celulas Huh-7 reduce drásticamente la expresión
de proteínas y la síntesis de RNA en un 90%.
Ventajas
Desventajas
Son productos específicos de secuencia,
natural y celulares.
Su acción es de vida corta en mamíferos
(mejora de la resistencia a nucleasas).
No produce metabolitos tóxicos.
No se tienes buenos métodos para el
trasporte de los siRNA hacia células blancos.
Es capaz de inhibir la replicación del VHB y
de expresión in vitro e in vivo.
Silenciamiento de HIV
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siRNAs pueden inhibir la producción de virus en cultivo celular, mediando su
degradación y disminuyen la expresión del genoma viral.
siRNAs regula la expresión del receptor CD4 y de los co-receptores CXCR4
celulares y CCR5, previniendo la entrada de VIH-1.
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siRNA pueden inhibir la replicación viral en varias etapas de la infección,
incluidas las fases muy tempranas.
siRNA específicos administrados a células humanas desde el exterior, como un
fármaco, protegiendo contra la infección por el VIH se multiplican con
rapidez.
si el siRNA se expresara en el interior de las células, en lugar de limitarse a
administración desde el exterior, las células se volverían inmunes al VIH -1.
Interferencia del RNA en Cáncer
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En implementación de siRNA en la terapia del cáncer:
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Modelos animales y vectores virales con cassettes de expresión.
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Combinación de técnicas:
 siRNA dirigidos a HIF-1 con radiación ionizante.
 Complejos de siRNA Anti-bcl-2 con liposomas (lipidos cationicos)
en el modelo de ratón de metástasis hepática.
 Administración de siRNA Anti-PLK-1/liposoma
en modelo de
ratón de cancer de vejiga.
 siRNA combinado con Anticuerpos especificos: Anticuerpos antiErbB2 unido a un siRNA en las células de cáncer de mama.
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Modelos Knock-Out basados en RNAi en combinación con terapias de
inhibición de HIF-1 (cáncer in vivo).
Enfermedades como el cáncer se consideran como enfermedades
sistémicas, por lo tanto requieren el tratamiento sistémico con siRNA.


Utilizando de vectores de genes promotor específicos (tejido o células).
Anticuerpos específicos unidos a moléculas transportadoras, reduciendo dosis y
efectos colaterales.
Ventajas de interferencia de RNA
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Desempeña un papel en la protección celular frente a virus y transposones en
plantas e insectos.
dsRNA activa procesos normales que conducen a la degradación del RNA,
así como de propagación del silenciamiento célula-célula.
Ayuda a mejorar el análisis genético de varios modelos tradicionales de
organismo.
Regular la expresión génica, evaluando sus funciones fisiológicas en las
plantas y seres humanos (Knock-Modelo).
Usos potenciales de RNAi
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Terapia en el silenciamiento de genes basado en dsRNA.
Método fiable y rápido para la creación de mutantes y la realización de
estudios de genes Knock-out y perdida de fenotipo.
Evaluación de funciones de proteínas, como el descubrimiento de enzimas y
proteínas implicadas en determinadas vías metabólicas (acido Abscísico/
Giberelinas).
Inducción de RNAi por transcripción bi-direccional de un gen en particular o
el flankeo de un gen para ser silenciado por dos promotores convergente.
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El empleo de RNAi en estudio de células de mamíferos se obstaculizado por
2 problemas:


Activación de una cinasa (PKR), que retrasa la traduccion mediante la fosforilación
de un factor de iniciación (eIF2a).
Es la activación de la RNasa L, la cual degrada el ARNm de la célula de manera
no específica a la inducción al dsRNA.
Direcciones a futuro
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Posible vínculo con la inactivación del cromosoma X, impronta e
interferones se ha sugerido, pero aún no está firmemente establecida.
Un mejor estudio sobre el PTGS permitirá una respuesta mas eficiente
contra infecciones virales y el desarrollo de asociaciones
trasgene/huesped que anulen el silenciamiento de permitir la expresión de
proteínas de interés.
Establecer una inmunización intracelular mediante el uso de sRNA en lugar
de proteínas.
El potencial RNAi para el tratamiento de enfermedades virales y el cáncer
se ha despertado un gran interés en el ámbito científico (VIH, VPH,
poliomielitis o genes cancerígenos).