Transcript Análisis de secuencias

Curs
Curs d’introducció
d’introducció aa la
la bioinformàtica
bioinformàtica
Plataforma Bioinformàtica de la UAB
Introducció a la Bioinformàtica
Bioinformàtica: la recerca
biomèdica in silico
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Alineamiento de secuencias
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Alineamiento de secuencias
Alineamiento
Comparar dos (alineación a pares) o más
(alineación múltiple) secuencias para buscar
una serie de caracteres o patrón de caracteres
que están en el mismo orden en las
secuencias
Secuencia 1:
Secuencia 2:
ATGCGACTGACG
||||||||||||
ATGCGACTGACG
Significado de un alineamiento
Estadístico
Por azar (alineamiento de secuencias al azar pueden
producir un 20% identidad)
Biológico
Comparten un ancestro común. Implica una información
funcional, estructural y evolutiva?
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Alineamiento de secuencias
Un alineamiento compara permitiendo:
• Identificar genes homólogos/similares
• Asignar funciones biológicas (reales, posibles?)
• Predecir estructura
• Encontrar patrones
• Reconstruir relaciones evolutivas
• ……
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Homología vs similitud
Homólogo, similar, idéntico
• Homología
– dos secuencias son homólogas sólo si derivan de
una ancestro común
– implica una herencia compartida
– cualitativo
– se es homólogo o no se es
• Similitud
– medida cuantitativa
– se puede usar una medida de similitud para inferir
homología
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Global vs Local
Global:
Intentamos alinear todos los caracteres de
las secuencias optimizando el número máximo de
identidades
Local:
Alineamos segmentos de las secuencias
donde la densidad de identidades es mayor,
generamos subalinemientos
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Alineamiento de secuencias
Un proceso de alineamiento debe efectuar una
búsqueda activa del mejor alineamiento posible y debe
considerar los cambios que sufren las secuencias:
• Identidades -> Emparejamientos (match)
• Sustituciones -> Desemparejamientos (mismatch)
• Deleciones e inserciones (indel) -> Huecos (gaps)
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Alineamiento de secuencias
Cómo decidir cuál es el mejor?
• Respuesta: el más significativo desde el
punto de vista biológico
• Pero: necesitamos una medida objetiva
• Sistemas de puntuación (scoring)
– reglas para asignar puntos
– el más simple: match, mismatch, gap
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Fernán Agüero
Valoración de un alineamiento
Valoración (score) de un alineamiento
Máxima puntuación = Alineamiento óptimo
F (puntuación emparejamiento
Puntuación = idéntico, puntuación
emparejamiento similar,
puntuación huecos –gap-)
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Valoración de un alineamiento
Como valorar un alineamiento?
Ejemplo
Identidad = 1
Missmatch = 0
Gap = -1
Score = 10 - 4 = 6
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Matriz para DNA
Una matriz no es otra
cosa que un sistema de
scoring que permite
asignar puntuaciones
individuales a cada una
de las letras del
alfabeto en uso
Fernán Agüero
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Matriz para DNA
A
G
C
T
A
+1
–3
–3
–3
G
–3
+1
–3
–3
C
–3
–3
+1
–3
T
-3
-3
-3
+1
CAGGTAGCAAGCTTGCATGTCA
|| |||||||||||| |||||
CACGTAGCAAGCTTG-GTGTCA
Score
Match: + 1
Mismatch: - 3
raw score = 19-9 = 10
Score
Match: + 1
Mismatch: -10000
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Matriz para DNA
Modelos evolutivos DNA
Matriz de substitución para DNA
Transiciones / Transversiones
p(transición) > p(transversión)
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Ejemplo:
A,A = 1
A,C = 0
C,T = 0,5
Gap = -1
Matriz para proteínas
Matrices de puntuación para proteínas
Matriz de identidad
Secuencia A
Secuencia B
Tyr Cys Asp Ala Met
Phe Met Glu Gly Met
0
0
0
0
1
Puntuación total del alineamiento: 0+0+0+0+1 = 1
Matrices de susbtitución
Secuencia A
Secuencia B
Tyr Cys Asp Ala
Phe Met Glu Gly
3 -1
2
0
Puntuación total del alineamiento: 3-1+2+0 = 4
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Matriz para proteínas
Modelos evolutivos Proteínas
Mutaciones (código genético)
Substituciones conservativas
Matriz de substitución para proteínas
•PAM 60, 120, 250 (Dayhoff)
Extrapolación desde PAM1
•BLOSUM 80, 62, 40
Basadas en
secuencias
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BLOCKS
de
Matrices PAM (Percent Accepted Mutation)
Evolutionary model
• Creadas partiendo de un grupo de secuencias homólogas con
un porcentage de similitud igual o superior al 85 %.
• Proporcionan los cambios esperados entre proteínas
homólogas a lo largo de un determinado periodo evolutivo
• Generan una matriz 20 x 20
• Todas calculadas a partir de PAM1 (identidades aprox 99%)
• Se pueden extrapolar los cambios esperados en periodos
cortos a los esperados en periodos largos simplemente
multiplicando la matriz original n veces.
• La más utilizada: PAM 250 (identidades aprox 20%)
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Matrices BLOSUM (BLOck SUbstitution Matrices)
•Creadas utilizando un gran número de secuencias NO
homólogas pertenecientes a distintas familias
•Se evaluan las tasas de sustitución en patrones de residuos
altamente conservados (BLOCKS)
•Generan matrices 20 x 20
•Las distintas matrices se generan usando agrupaciones de
bloques con mayor o menor grado de similitud
•La matriz por defecto: BLOSUM62
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Matriz PAM 250
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Blosum 62
A 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
E -1 0 0 2 -4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
F
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2
T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2
Negative
for -4
less-2likely
substitutions
W -3 -3 -4
-2 -3
-2 -2 -3 -2 -3 -1 1
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1
Positive for more likely substitutions
4
X 0 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
1 -1
A R N D C Q E G H I L K M F
V X
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Los scores provienen
del la observación de
los tipos y frecuencias
de sustitución en
distintas familias
proteicas
7
-1 4
-1 1 5
-4 -3 -2 11
-3 -2 -2 2 7
-2 -2 0 -3 -1
-2
0
0 -2 -1 -
P
S
T
W
Y
Equivalencia PAM - BLOSUM
PAM100 ==> Blosum90
PAM120 ==> Blosum80
PAM160 ==> Blosum60
PAM200 ==> Blosum52
PAM250 ==> Blosum45
BLOSUM: “mejor” para la detección alineamientos locales
BLOSUM 62, detección similitudes débiles
BLOSUM 45, detección alineamientos largos y débiles
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PAM vs BLOSUM
•PAM asume un modelo de evolución markoviano (todos los
cambios independientes)
•BLOSUM no supone ningún modelo evolutivo explícito
•PAM considera todas las posiciones amino acídicas
•BLOSUM considera sólo los cambios en posiciones dentro de
bloques conservados
•PAM asume que la distribución de aa de las secuencias que la
generaron es representativa de todas las familias de proteínas
•BLOSUM se generó usando un mayor número de secuencias y de
familias distintas
•PAM requiere un conocimiento previo de la distancia evolutiva
Conclusión:
PAM es más adecuada para trazar el origen evolutivo de proteínas
BLOSUM es más apropiada para hallar dominios conservados
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Valoración de un alineamiento: gaps
Gap penalty
W = g - r(x-1)
W es la puntuación
x la longitud del gap
g la penalización de abrir un gap
r la penalizaciónde extender un
gap
•Muchos programas de alineamiento sugieren los valores por
defecto
• Penalización al final del alineamiento
• Sí en secuencias homólogas misma longitud
• No en secuencias desconocidas o longitud diferente
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Valoración de un alineamiento: gaps
Valores de penalización de gaps
Programas de alineamiento de DNA
Programa
Tipo de
Match
alineamiento score
FASTA
local
5
Mismatch Penalización
Penalización
score
apertura gaps extensión gaps
-4
-16
-4
Programas de alineamiento de Proteínas
Programa
Tipo de
Match y Mismatch Penalización
Penalización
alineamiento
score
apertura gaps extensión gaps
FASTA
local
BLAST
local
Valores BLOSUM50
- 16
-12
-4
-2
Valores BLOSUM62
- 6
- 8
-4
-2
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Valoración de un alineamiento: gaps
Efecto de la variación en la penalización de huecos (gap)
(Vingron & Waterman 1994)
• Si se penaliza alto (relativamente) no aparecerán en el
alineamiento
• Si bajo, gaps serán ubicuos
• Si la penalización gaps y desemparejamientos (mismatch) es
alta habrá un alineamiento local con emparejamientos exactos
El alineamiento de proteínas relacionadas muestran que gaps >
5 nunca ocurren
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Métodos de alineamiento
Métodos de alineamiento de dos
secuencias
•Dot Matrix (Matriz de puntos)
Rápida identificación de indels / No alineamientos óptimos
•Dynamic Programming (Programación dinámica)
Garantiza alineamiento óptimo / Computacionalmente
costoso
•Heuristic Searches (Búsquedas heurísticas)
Búsquedas rápidas en bases de datos grandes /
alineamientos locales y no siempre óptimos
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Dot Matrix
Matriz de puntos (Dot matrix, Gibbs & McIntyre 1970)
Se ponen de manifiesto todos los emparejamientos posibles pero es el investigador quien
debe determinar cuales son significativos
C|
X
X
G|
X
T| X :
T| X
A|X
+-------A T C G C
A T T G C
| | : | |
A T C G C
A| X
C|
X
G|X
X
T|
X
A|- X
+--------G A T G C
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- A T G C A
| | | |
G A T G C
Alineamiento: matriz de puntos
Matriz de puntos (Dot matrix)
A|X
X
X
T| X
X
G|
X
.
T| X
.
C|
X
.
A|X
X
C|
X
T| X
X
A|X
X
+------------A T C A G T A
A T C A C T G T A
| | | |
| | |
A T C A - - G T A
Detección de indels: inserciones / deleciones
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Alineamiento: matriz de puntos
Matriz de puntos de dos proteínas represoras en
fagos, λ cI y P22 c2
•
Nucleótidos
• Ventana = 11 (longitud del
bloque)
• Astringencia = 7 (Mínima
coincidencia admitida)
•11/7 ó 15/11
Aminoácidos
• Ventana = 1
• Astringencia = 1
•1/1 excepto búsquedas
pequeños dominios 15/5
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Alineamiento: matriz de puntos
Matriz de puntos de
la proteína
receptora humana
LDL con ella misma.
• Ventana = 23
• Astringencia = 7
•
Ventana = 1
• Astringencia = 1
•
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Alineamiento: matriz de puntos
Dot plots sugieren
caminos (paths) a
través del espacio de
alineamientos posibles.
Dominios EGF conservados en la urokinse plasminogen
activator (PLAU) y el
tissue plasminogen activator
(PLAT)
23
72
90
23
137
72
90
137
Path graphs son
representaciones
más explícitas de
un alineamiento.
Cada path es un
alineamiento único.
PLAU
PLAT
90
23
EPKKVKDHCSKHSPCQKGGTCVNMP--SGPH-CLCPQHLTGNHCQKEK---CFE
ELHQVPSNCD----CLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKTCYE
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137
72
Programación dinámica
Algoritmos de programación dinámica
Métodos computacionales que comparan cada pareja de
caracteres y los posicionan de forma que el número de
emparejamientos idénticos o relacionados sea el máximo
posible
Alineamiento global de Needlman-Wunsh (1970)
Alineamiento local de Smith-Waterman (1981)
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Programación dinámica
Evalúa y puntúa todos los posibles emparejamientos para cada
caracter y lo posiciona en función de dicha puntuación y de la
puntuación total de los caracteres ya alineados, construyendo
una “ruta” hacia el alineamiento óptimo o de mayor puntuación
Uso de un algoritmo recursivo que añade residuos en una
posición sobre el alineamiento mejor hasta esa posición. Una
ruta óptima que termina en un nodo debe pasar por uno de los
tres nodos previos
S(i,j) = max
S(i-1,j-1) + c(i,j)
S(i-1,j) + c(i,-)
S(i,j-1) + c(-,j)
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Programación dinámica
A
Score nuevo =
alineamiento
VDS- C
VESLC
8
Score alineamiento + Score del nuevo
previo
emparejamiento
VDSVESL
=
-1
C
C
+
9
B
VDS- CY
VESLCY
15
=
VDS- C
VESLC
8
Y
Y
+
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7
Dynamic programming: ejemplo
Un ejemplo:
Construir un
alineamiento óptimo
entre estas dos
secuencias
Utilizando las
siguientes reglas de
scoring:
G A T A C T A
G A T T A C C A
Match:
+1
Mismatch:
-1
Gap:
-1
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Fernán Agüero
Dynamic programming: ejemplo
Ordenar las dos
secuencias en una
matriz bidimensional
Los vértices de cada
celda se encuentran
entre letras (bases).
Needleman & Wunsch
(1970)
G A T A C T A
G
A
T
T
A
C
C
A
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Fernán Agüero
Dynamic programming: ejemplo
El
objetivo
encontrar
la
(path) óptimo
es
ruta
G A T A C T A
G
A
T
T
A
C
C
A
Desde aquí
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Hasta acá
Fernán Agüero
Dynamic programming: ejemplo
Cada path corresponde a
un alineamiento único
G A T A C T A
G
A
T
T
A
C
C
A
Cuál es el óptimo?
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Fernán Agüero
Dynamic programming: ejemplo
G A T A C T A
El score para una
ruta (path) es la
suma incremental de
los scores de sus
pasos (diagonales o
lados).
G
A
T
T
A
C
C
A
A alineada con A
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Match = +1
Fernán Agüero
Dynamic programming: ejemplo
El score para una
ruta (path) es la
suma incremental de
los scores de sus
pasos (diagonales o
lados).
G A T A C T A
G
A
T
T
A
C
C
A
A alineada con T
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Mismatch = -1
Fernán Agüero
Dynamic programming: scores: gaps
El score para una
ruta (path) es la
suma incremental de
los scores de sus
pasos (diagonales o
lados).
G A T A C T A
G
A
T
T
A
C
C
A
T alineada con NADA
Gap = -1
T
alineada con NADA
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Fernán Agüero
Dynamic programming: paso a paso
(1)
Extender el path paso por paso
G
–
G
G
G
–
+1
-1
-1
G
A
T
T
A
C
C
A
0
-1
G A T A C T A
-1
+1
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Fernán Agüero
Dynamic programming: paso a paso
(2)
Incrementar el path paso a paso
Recordar
el
mejor
subpath que lleva a
cada
punto
en
la
matriz.
G
A
T
T
A
C
C
A
0
-1
G A T A C T A
-1
-2
+1
-2
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Fernán Agüero
Dynamic programming: paso a paso
(3)
Incrementar el path paso a paso
Recordar
el
mejor
subpath que lleva a
cada
punto
en
la
matriz.
G
A
T
T
A
C
C
A
0
-1
G A T A C T A
-1
-2
+1
-2
0
0
+2
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Fernán Agüero
Dynamic programming: paso a paso
(4)
Incrementar el path paso a paso
Recordar
el
mejor
subpath que lleva a
cada
punto
en
la
matriz.
G
A
T
T
A
C
C
A
0
G A T A C T A
-1
-2
-1
+1
-2
0
-2
0
+2
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Fernán Agüero
Dynamic programming: paso a paso
(5)
Incrementar el path paso a paso
Recordar
el
mejor
subpath que lleva a
cada
punto
en
la
matriz.
G
A
T
T
A
C
C
A
0
G A T A C T A
-1
-2
-3
-1
+1
-2
0
-1
-2
0
+2
+1
-3
-1
+1
+3
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Fernán Agüero
Dynamic programming: paso a paso
(6)
Incrementar el path paso a paso
Recordar
el
mejor
subpath que lleva a
cada
punto
en
la
matriz.
G
A
T
T
A
C
C
A
0
G A T A C T A
-1
-2
-3
-4
-5
-1
+1
0
-1
-2
-3
-2
0
+2
+1
0
-1
-3
-1
+1
+3
+2
+1
-4
-2
0
+2
+2
+1
-5
-3
-1
+1
+3
+2
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Fernán Agüero
Dynamic programming: paso a paso
(7)
Incrementar el path paso a paso
Recordar
el
mejor
subpath que lleva a
cada
punto
en
la
matriz.
G
A
T
T
A
C
C
A
0
G A T A C T A
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-1
+1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-2
0
+2
+1
0
-1
-2
-3
-3
-1
+1
+3
+2
+1
0
-1
-4
-2
0
+2
+2
+1
+2
+1
-5
-3
-1
+1
+3
+2
+1
+3
-6
-4
-2
0
+2
+4
+3
+2
-7
-5
-3
-1
+1
+3
+3
+2
-8
-6
-4
-2
0
+2
+2
+4
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Fernán Agüero
Dynamic programming: best path
Recorrer el camino de
atrás hacia adelante para
obtener el mejor path y
alineamiento.
G
A
T
T
A
C
C
A
0
G A T A C T A
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-1
+1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-2
0
+2
+1
0
-1
-2
-3
-3
-1
+1
+3
+2
+1
0
-1
-4
-2
0
+2
+2
+1
+2
+1
-5
-3
-1
+1
+3
+2
+1
+3
-6
-4
-2
0
+2
+4
+3
+2
-7
-5
-3
-1
+1
+3
+3
+2
-8
-6
-4
-2
0
+2
+2
+4
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Fernán Agüero
Dynamic programming: alineamiento
obtenido
G A T A C T A
Imprimir el alineamiento
G A - T A CT A
G A T T A CC A
G
A
T
T
A
C
C
A
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Fernán Agüero
Dynamic programming: SmithWaterman
• El método fue modificado (Smith-Waterman)
para obtener alineamientos locales
• El método garantiza la obtención de un
alineamiento óptimo (cuyo score no puede
ser mejorado)
• La complejidad es proporcional al producto
de las longitudes de las secuencias a alinear
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Fernán Agüero
Programación dinámica
Alineamiento
global de
NeedlmanWunsh
Preparación de una matriz n x m
S(i,j) = max
S(i-1,j-1) + c(i,j)
S(i-1,j) + c(i,-)
S(i,j-1) + c(-,j)
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Ejemplo on-line:
alineamiento global vs local
Preparación de una matriz n x m
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Ejemplo on-line:
alineamiento global vs local
M N A L S D RT - - |
| | | |
M G - - S D RTT E T
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Ejemplo on-line:
alineamiento global vs local
M N A L SD R - T - |
| | |
|
M G - - S D RTT E T
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Ejemplo on-line:
alineamiento global vs local
M N A L SD R - - - T
|
| | |
|
M G - - S D RTT E T
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Ejemplo on-line:
alineamiento global vs local
M N A L SD R - - - T
|
| | |
|
M - - G S D RTT E T
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Ejemplo on-line:
alineamiento global vs local
M N A L SD R - T - |
| | |
|
M - - G S D RTT E T
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Ejemplo on-line:
alineamiento global vs local
M N A L SD RT - - |
| | | |
M - - G S D RTT E T
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Programación dinámica
Alineamiento 1
sequence 1
sequence 2
score
M - N
M G S
6 -12 1
A L
D R
0 -3
S
T
1
D R
T E
0 -1
T
T
3
=
-5
Alineamiento 2
sequence 1
sequence 2
score
M
M
6
N - A L
G S D R
0 -12 0 -3
S
T
1
D R
T E
0 -1
T
T
3
=
-6
Alineamiento 3 (no penalización de gap final)
sequence 1
sequence 2
score
M
0
N A L
- M G
0 -1 -4
S
S
2
D
D
4
R
R
6
T
T
3
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T
0
E
0
T
0
=
10
Programación dinámica
Alineamiento local con el algoritmo de Smith-Waterman
• Debe haber
puntuación negativa
para los
desemparejamientos y
si la puntuación de la
matriz obtiene un valor
negativo se pone 0
• Así el alineamiento
puede empezar en
cualquier punto y se
acaba cuando la
puntuación alcanza el
valor de 0
secuencia 1
secuencia 2
score
SDRT
SDRT
2 4 6 3 = 15
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Alineamiento global y local
Needleman & Wunsch (1970)
Smith & Waterman (1981)
Las secuencias se
alinean
esencialmente de
un extremo a otro
Las secuencias se
alinean en regiones
pequeñas y aisladas
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Heuristic searches
MPKRSEYRQGTPNWVDLQTTDQSAAKKFYTLFGWGYDDNPVPGGGGVY
SMATLNGEAVAAIAPMPPGAPEGMPPIWNTYIAVDDVDAVVDKVVPGG
GQVMMPAFDIGDAGRMSFITDPTGAAVGWQANRHIGATLVNETGTLIW
NELLTDKPDLALAFYEAVVGLTHSSMEIAAGQNY
¿Hay en la base de datos
alguna secuencia similar
a mi secuencia
problema?
Búsquedas por
similitud
Resultados
Similar to …………
Unknown but similar to sevral hypothetical proteins from…
Putative hypothetical protein……..
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Búsqueda de similares
Búsqueda de similares en
una base de datos
Objetivo: comparar una secuencia frente a una base
de datos, comprar doss base de datos,..
•Algoritmos
Exactos:
Smith-Waterman
(sssearch,
lalign,
..)
Heurísticos:
BLAST
(búsqueda
de
“words”
similares)
FASTA (búsqueda de “k-tuplos” idénticos)
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Métodos heurísticos
Método heurístico: prueba y error
Suele encontrar secuencias relacionadas pero nunca
hay garantía absoluta.
Ventaja: 50 veces más rápido que programas dinámicos
Usos: búsquedas sobre bases de datos de gran tamaño
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)
(Altschul, et al, 1990, J Mol Biol, 215:403-10)
Concentra la búsqueda en patrones cortos más significativos, (palabra,
word size: 3 aa / 11 nt). Rápido, menos sensible?
FASTA
(Lipman y Pearson, 1985; Pearson y Lipman, 1988)
El algoritmo busca patrones cortos consecutivos (palabras o k-tuplos, k=
1-2 aa / 4-6 nt) entre la secuencia problema y las de la base de datos.
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Secuencias problema
Búsquedas con secuencias de DNA o aa
FASTA, BLAST
>SeqDNA_Prob1.seq
ATGAAGGACTTAGTCGATACCACAGAGATGTACTTGCGTACTATCTATGAGC
TGGAAGAAGAGGGAGTCACCCCTCTTCGCGCTAGGATCGCTGAGCG
Búsquedas con perfiles
Archivos con alineamientos
D-HQSNGA
ESHQ-YTM
EAHQSN-L
EGVQSYSL
 Búsquedas con Blocks
DAHQSN
ESHQSY
EAHQSN
EGVQSY
Motivos alineados sin gaps
(PSSM position-specific scoring matrix)
Búsquedas de patrones y motivos
PROSITE, INTERPRO, PFAM, ..
DAHQSN
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Significación - Valoración
de los alineamientos
1.
Valoración mediante matrices
2.
Penalización por disimilitud (aparición y extensión de gaps). Este valor es
la Puntuación bruta (raw score, Sraw).
3.
Puntuación de bits (Sbit). Permite comparar resultados obtenidos por
diferentes sistemas. Se introducen parámetros utilizados por el programa
de alineamiento.
4.
E value alineamiento debido al azar. Los valores más cercanos a cero
indican una mayor relevancia. Se puede considerar relevante cuando E <
0.05.
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Significancia
Expect Value
E = numero de hits esperado por azar
Un E-value de 10 significa que, en una base
de datos de igual tamaño, se pueden
encontrar 10 alineamientos con la misma
puntuación por simple azar.
Valores mas bajos serán mas significativos
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(Basic Local Alignment Search Tool)
Altschul, et al, 1990, J Mol Biol, 215:403-10
Heurístico
BLAST intenta encontrar muchos matches sacrificando la especificidad
por la velocidad. Se pueden perder apareamientos.
Estrategia BLAST
Búsqueda de proteínas mediante criterios de semejanza (no
identidad).
Se utilizan matrices de semejanza
Trabaja con segmentos pequeños que permiten acelerar el proceso
(High-scoring segment pair)
Extensión de los match hacia los lados
Rápido y sensible
Usos
búsquedas en las bases de datos
alineamiento de pares de secuencias
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Glossary
Esquema BLAST
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Nucleótidos
Query:
GTACTGGACATGGACCCTACAGGAA
Word Size = 11
GTACTGGACAT
TACTGGACATG
ACTGGACATGG
CTGGACATGGA
TGGACATGGAC
GGACATGGACC
GACATGGACCC
ACATGGACCCT
...........
Minimum word size
=7
blastn default = 11
megablast default =
28
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Proteínas
Query:
GTQITVEDLFYNIATRRKALKN
Word Size = 3
GTQ
TQI
Similares
QIT
LTV, MTV, ISV, LSV, etc.
ITV
TVE
VED
EDL
DLF
...
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Selección
del
programa
BLAST Help
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© 2006 Plataforma Bioinformàtica de la UAB
© 2006 Plataforma Bioinformàtica de la UAB
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Opciones
Conserved Domain Database
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Introducción de la Secuencia
FASTA FORMAT
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Otras opciones
Expect: 10, máximo de 10 al azar. Valores
inferiores son mas restrictivos.
Word Size: medida de los fragmentos (k-tup
FASTA)
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Formatos
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Práctica
Objetivo general
Buscar secuencias similares a las secuencias problema.
BLAST DNA
Copiar la Secuencia PROBLEMA i someterla a BLAST de
DNA
>SeqDNA_Prob1.seq
ATGAAGGACTTAGTCGATACCACAGAGATGTACTTGCGTACTATCTATGAGCTGGAAGAAGAG
GGAGTCA
CCCCTCTTCGCGCTAGGATCGCTGAGCGTCTGGAACAATCTGGACCTACAGTTAGCCAAACCG
TTGCCCG
TATGGAGCGCGATGGACTTGTCGTTGTCGCCTCAGACCGCAGTCTACAAATGACACCGACAGG
CCGCACT
TTAGCGACTGCAGTTATGCGTAAACATCGCTTAGCTGAGCGCCTTCTTACCGATATCATTGGTC
TAGATA
TCAATAAAGTTCACGATGAAGCCTGCCGCTGGGAACACGTTATGAGTGACGAAGTTGAACGCA
GGCTCGT
GAAAGTATTGAAAGATGTCAGTCGGTCCCCCTTCGGAAACCCAATTCCAGGTCTCGACGAACT
CGGCGTA
GGCAATTCTGACGCGGCAGCCCCCGGAACTCGCGTTATTGACGCTGCCACCAGCATGCCCCG
CAAAGTAC
GCATTGTTCAGATTAACGAAATCTTTCAAGTTGAAACGGATCAGTTTACACAGCTCCTCGATGC
TGACAT
CCGTGTTGGATCAGAAGTCGAAATTGTAGATAGAGACGGCCACATCACGTTGAGCCACAATGG
AAAAGAT
GTCGAACTCCTCGATGATCTGGCTCACACTATTCGTATCGAAGAACTCTAA
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Práctica
BLAST Proteína
Copiar la secuencia PROBLEMA i someterla a BLAST de
Proteína
>SeqProt-Prob1.pep
MENRIDRIKKQLHSSSYKLTPQREATVRVLLENEEDHLSAEDVYLLVKEKSPEIGLATVY
RTLELLTELKVVDKINFGDGVSRYDLRKEGAAHFHHHLVCMEFGAVDEIEGDLLEDVEEI
IERDWKFKIKDHRLTFHGICHRCNGKETE
Iniciar una sesión BLAST Protein
Limitar la búsqueda a Blast de Bacteria
Ejecutar Blast
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Práctica t
n
Proteína x DNA traducido a Proteína
Objetivo
Pretendemos encontrar secuencias bacterianas en diferentes
genomas de microorganismos.
Realizar una búsqueda tBLASTn sobre genomas microbianos
utilizando la secuencia:
>Proteína problema
MPKRSEYRQGTPNWVDLQTTDQSAAKKFYTSLFGWGYDDNPVPGGGGVYSMATLNGEAVAAIAPMPPGA
P
EGMPPIWNTYIAVDDVDAVVDKVVPGGGQVMMPAFDIGDAGRMSFITDPTGAAVGLWQANRHIGATLVNE
TGTLIWNELLTDKPDLALAFYEAVVGLTHSSMEIAAGQNYRVLKAGDAEVGGCMEPPMPGVPNHWHVYFA
VDDADATAAKAAAAGGQVIAEPADIPSVGRFAVLSDPQGAIFSVLKPAPQQ
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Práctica
X
DNA traducido a Proteína x Proteína
Objetivo
Detectar similares a la secuencia problema y determinar si hay errores.
Realizar una búsqueda con BLASTx usando:
>DNA desconocido
ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAAGGCACGCCGAACTGGGTCGACCTTCAGACCACCGATCAGTCCG
CCGCCAAAAAGTTCTACACATCGTTggtGTTCGGCTGGGGTTACGACGACCCGGTCCCCGGAGGCGGTGG
GGTCTATTCCATGGCCACGCTGAACGGCGAAGCCGTGGCCGCCATCGCACCGATGCCCCCGGGTGCACCG
GAGGGGATGCCGCCGATCTGGAACACCTATATCGCGGTGGACGACGTCGATGCGGTGGTGGACAAGGTGG
TGCCCGGGGGCGGGCAGGTGATGATGCCGGCCTTCGACATCGGCGATGCCGGCCGGATGTCGTTCATCAC
CGATCCGACCGGCGCTGCCGTGGGCCTATGGCAGGCCAATCGGCACATCGGAGCGACGTTGGTCAACGAG
ACGGGCACGCTCATCTGGAACGAACTGCTCACGGAttgGCCGGATTTGGCGCTAGCGTTCTACGAGGCTG
TGGTTGGCCTCACCCACTCGAGCATGGAGATAGCTGCGGGCCAGAACTATCGGGTGCTCAAGGCCGGCGA
CGCGGAAGTCGGCGGCTGTATGGAACCGCCGATGCCCGGCGTGCCGAATCATTGGCACGTCTACTTTGCG
GTGGATGACGCCGACcccACGGCGGCCAAAGCCGCCGCAGCGGGCGGCCAGGTCATTGCGGAACCGGCTG
ACATTCCGTCGGTGGGCCGGTTCGCCGTGTTGTCCGATCCGCAGGGCGCGATCTTCAGTGTGTTGAAGCC
CGCACCGCAGCAATAG
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FASTA
Alineamientos locales
FASTA utiliza una matriz de
substitución sólo durante la fase de
extensión
La reducción del tiempo de búsqueda
conlleva una pérdida de sensibilidad y
selectividad
Estrategia
1.
2.
3.
4.
Búsqueda de zonas comunes por
identidad y sin gaps. Uso de k-tuplo.
Velocidad y sensibilidad determinadas
por la longitud de la palabra usada. Las
palabras cortas hacen la búsqueda
más lenta y sensible.
Valoración de los match por similitud y
unión de las regiones con gaps
Evaluación exhaustiva de los mejores
alineamientos
k-tup
DNA: 6
Proteína: 2
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Programas FASTA
Programa
Funciones
fasta3
tfasta3*
DNA, proteína frente bd DNA y bd Prot (fasta) y proteínas
frente bd DNA traducido (tfasta), no admite frameshifts
ssearch*
DNA, proteína frente bd DNA y bd Prot mediante el algoritmo
Smith-Waterman
Muy lento <10 fasta pero muy sensible.
fastx/y3
DNA (traducido 3 frames) frente bd proteínas. Admite gaps y
frameshifts
Velocidad x > y
tfastx/y3
Proteína frente bd DNA traducido 6 frames
fasts3
tfasts3*
Mezcla de péptidos pequeños relacionados (mass-spec)
frente bd proteína (fasts) o bd DNA (tfasts)*
fastf3
tfastf3*
>mgstm1
MILG,
MLLEYTD,
MGDAP
Mezcla de péptidos (obtenida por Edman o CNBr) frente bd
proteína (fastf) o bd DNA (tfastf)*
>mgstm1
MGCEN,
MIDYP,
MLLAY,
MLLGY
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Opciones FASTA
MATRIX
Matriz de búsqueda
GAP PENALTIES
GAPOPEN: Penalización por apertura gap (-12 para proteínas, -16 para DNA).
GAPEXT: Penalización extensión del gap (-2 para proteínas, -4 para DNA).
HISTOGRAM
Muestra el histograma con las frecuencias de las coincidencias por azar.
SCORES
Puntuación de los alineamientos
ALIGNMENTS
Número de alineamientos que se visualizaran
KTUP
Proteínas: 2
DNA: 6
STRAND
Cadena de DNA
EXPECTATION VALUE
Límite superior para la presentación de un alineamiento.
Valores por defecto son 10.0 para Prot/Prot; 5.0 para proteínas frente Prot/Prot de DNA y 2.0
para búsquedas DNA/DNA.
EXPECTATION VALUE THRESHOLD
Límite inferior para la presentación de un alineamiento.
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Job FASTA
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Resultados FASTA
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Mview Results FASTA
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Visual FASTA
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Práctica FASTA
Búsqueda por similitud
•Iniciar una sesión FASTA
•Seleccionar el programa y fijar los parámetros
de búsqueda en función de la naturaleza de la
secuencia problema.
•Introducir la secuencia problema
•Someter la búsqueda
•Visualizar y comentar los resultados
•Diferencias frente a BLAST
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Comparación múltiple de
secuencias
Alineamiento
múltiple = Tabla 2D
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
I
Y
D
G
G
A
V
-
E
A
L
II
Y
D
G
G
-
-
-
E
A
L
III
F
E
G
G
I
L
V
E
A
L
IV
F
D
-
G
I
L
V
Q
A
V
V
Y
E
G
G
A
V
V
Q
A
L
Cons
y
d
G
G
A/I
V/L
V
e
A
l
•Identificación de regiones conservadas
•Predicción de estructuras y funciones
•Diseño de experimentos para probar y modificar
funciones de proteínas concretas
•Identificación de nuevos miembros de una familia de
proteínas
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Comparación múltiple de
secuencias
FHIT_HUMAN -----------MS-F RFGQHLIKP-SVVFL KTELSFALVNRKPVV PGHVLV...
APH1_SCHPO -----------MPKQ LYFSKFPVG-SQVFY RTKLSAAFVNLKPIL PGHVLV...
HNT2_YEAST MILSKTKKPKSMNKP IYFSKFLVT-EQVFY KSKYTYALVNLKPIV PGHVLI...
Y866_METJA -----------MCIF CKIINGEIP-AKVVY EDEHVLAFLDINPRN KGHTLV...
Un método de alineamiento múltiple verdadero,
debería alinear todas las secuencias al mismo tiempo.
Pero no existe un método computacional que pueda
realizar esto en tiempo razonable
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Cómo se resuelve un alineamiento múltiple
de 3 secuencias?
•
•
Usando Prgramación dinámica en una matriz tridimensional
Objetivo: encontrar el camino óptimo
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Complejidad del algoritmo de
Programación Dinámica (PD)
•
El número de comparaciones que el PS tiene debe realizar para
llenar la matriz (sin usar heurísticas y excluyendo gaps) es el
producto de las longitudes de las dos secuencias (N x M)
•
La complejidad del algoritmo crece en forma exponencial con el
número de secuencias
Alinear dos secuencias de 300 nt implica realizar
300 x 300 = 90,000 comparaciones
Alinear tres secuencias de 300 nt implica realizar
300 x 300 x 300 = 27,000,000 comparaciones!!
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Aproximaciones al algoritmo de
Programación Dinámica
• Alinear todas las secuencias por pares
• Usar los scores para construir un árbol
• Alinear progresivamente (siguiendo el orden que
sugiere el árbol) todas las secuencias para producir un
Alineamiento Múltiple
No es un verdadero Alineamiento Múltiple
Las secuencias se alinean por pares
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Clustal W
Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. (1994)
"CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment
through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.";
Nucleic Acids Res. 22:4673-4680
Programa de alineamiento múltiple
Alineamiento progresivo
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Clustal W
Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J.
(1994)
"CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive
multiple sequence alignment through sequence weighting,
position-specific gap penalties and weight matrix choice.";
Nucleic Acids Res. 22:4673-4680
Estrategia general
Alineamiento rápido
• obtención de las mejores parejas
• análisis de clusters
• creación de un árbol guía
Alineamiento múltiple
• se utiliza el árbol guía anterior
• optimización alineamiento de los pares
más próximos
• introducción de gaps para mejorar el
alineamiento
• alineamiento de las parejas
• optimización mediante inclusión de
nuevos gaps
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Opciones Generales Clustal W
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CPU MODE
clustalw_mp - multiprocessor SGI systems.
clustalw - genérico (CPU simple)
ALIGNMENT
Permite realizar alineamientos completos utilizando algoritmos restrictivos que generan un árbol guía o
algoritmos más rápidos.
OUTPUT
Formato del resultado (ALN, GCG, PHYLIP, PIR and GDE)
OUTORDER
Orden de las secuencias
COLOR
Muestra el alineamiento en colores (solo en formatos ALN or GCG)
AVFPMI
LW
RED
Small (small+ hydrophobic
(incl.aromatic -Y))
DE
BLUE
Acidic
RHK
MAGENTA
Basic
•":" = sustituciones conservadas
STYHC
NGQ
GREEN
Hydroxyl + Amine + Basic Q
•"." = sustituciones semi-conservadas.
Others
Gray
Línea consenso
•"*" = residuos idénticos o conservados en todas las secuencias
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Clustal W (EBI)
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Formato secuencias para Clustal W
Formato FASTA
>FOSB_HUMAN P53539 homo sapiens (human). fosb protein
MFQAFPGDYDSGSRCSSSPSAESQYLSSVDSFGSPPTAAASQECAGLGEMPGSFVPTVTA
ITTSQDLQWLVQPTLISSMAQSQGQPLASQPPVVDPYDMPGTSYSTPGMSGYSSGGASGS
GGPSTSGTTSGPGPARPARARPRRPREETLTPEEEEKRRVRRERNKLAAAKCRNRRRELT
DRLQAETDQLEEEKAELESEIAELQKEKERLEFVLVAHKPGCKIPYEEGPGPGPLAEVRD
Eliminar
LPGSAPAKEDGFSWLLPPPPPPPLPFQTSQDAPPNLTASLFTHSEVQVLGDPFPVVNPSY
espacios entre
TSSFVLTCPEVSAFAGAQRTSGSDQPSDPLNSPSLLAL
>FOSB_MOUSE P13346 mus musculus (mouse). fosb protein.
secuencias
MFQAFPGDYDSGSRCSSSPSAESQYLSSVDSFGSPPTAAASQECAGLGEMPGSFVPTVTA
ITTSQDLQWLVQPTLISSMAQSQGQPLASQPPAVDPYDMPGTSYSTPGLSAYSTGGASGS
GGPSTSTTTSGPVSARPARARPRRPREETLTPEEEEKRRVRRERNKLAAAKCRNRRRELT
DRLQAETDQLEEEKAELESEIAELQKEKERLEFVLVAHKPGCKIPYEEGPGPGPLAEVRD
LPGSTSAKEDGFGWLLPPPPPPPLPFQSSRDAPPNLTASLFTHSEVQVLGDPFPVVSPSY
TSSFVLTCPEVSAFAGAQRTSGSEQPSDPLNSPSLLAL
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Resultados
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Resultados JalView
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Resultados Clustal W (.dnd)
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Árboles
Phylodendron
Phylogenetic tree printer
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Práctica ClustalW - Primers
Comparación múltiple
• Abrir una sesión Clustal W
• Fija los parámetros e introduce las secuencias usando el archivo
múltiple al que hemos añadido todas las secuencias a alinear.
• Ejecutar Clustal W
• Visualizar los resultados
• Identificar y almacenar les regiones conservadas (primers)
Diseño primers
• Realizar una traducción reversa de los primers en la Sequence Manipulation
Suite de la Univ de Alberta
• Mediante las tablas de uso de codones, disminuir la degeneración de los primers
adaptándolos al uso del Microorganismo problema
Árboles
• Visualizar el archivo .dnd con Phylodendron (o TreeView local)
• Variar la topología del árbol enraizándolo a un outgroup arbitrario
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