Transcript R - Dodaj.rs

Питања за испит
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Типови особина које се уводе у биљке
генетским инжењерством
Основне класе ензима које се користе у
генетском инжењерству
Генске касете и конструкти
Главни типови вектора
Биолошки, физички и хемијски методи
трансформације биљака
Селекција и типови селектабилних маркера
Консултације:
 [email protected]
 IBISS, тел. 2078-431

Биотехнологија и генетичко
инжењерство биљака - 1. предавање
•
•
•
Увод у биотехнологију биљака
•
Историјат развоја биотехнологије
•
Примене биотехнологије
•
Биотехнологија биљака
Генетско инжињерство
•
Основни кораци генетског инжињерства
•
Генске касете
Ензими као алати
•
Нуклеазе
•
Рестрикционо/модификациони системи
•
ДНК и РНК лигазе
•
Полимеразе
•
Остали ензими
Биотехнологија
Биотехнологија се дефинише као примена традиционалних и/или
научних знања у манипулацији (делова) микроорганизама, или
ћелија и ткива виших организама, тако да они обезбеђују добра и
услуге корисне за прехрамбену и друге индустрије и њихове
кориснике.
Биотехнологија комбинује дисциплине попут генетике,
молекуларне биологије, биохемије, ембриологије, цитологије,
системске биологије и биоинформатике, као и практичне
дисциплине као што су хемијско инжињерство, информационе
технологије и роботика.
Традиционални приступи у биотехнологији биљака:
1) укрштање и селекција биљака и
2) прскање пестицидима и хербицидима
Историјат развоја биотехнологије
Хронологија развоја биотехнологије биљака
1700s
1860s
1900
1922
1953
1970s
1973
1983
1985
1986
1990
1992
1994
1995
2000
2001
Природњаци препознају и идентификују хибридне биљке
Аустријски монах и ботаничар Грегор Мендел проучава грашак и схвата да се специфичне
особине, касније дефинисане као гени, преносе са родитеља на потомке
Европски ботаничари почињу да побољшавају биљну продуктивност користећи генетичке теорије
засноване на Менделовом раду
Фармери набављају хибридна семена кукуруза направљена укруштањем два варијетета
Откриће структуре ДНК обележава почетак модерне генетике и молекуларне биологије
Зелена револуција: хибридна семена се уводе у земље у развоју, патуљасти мутанти
Прецизно манипулисање бактеријске ДНК помоћу техника генетичког инжињерства
Креирана прва генетички модификована (ГМ) биљка – дуван отпоран на један антибиотик
Тестирање у пољу ГМ биљака отпорних на вирусе, бактерије и инсекте
Агенција за заштиту природе (EPA, U.S. Environmental Protection Agency) одобрава пуштање у
промет прве ГМ биљке – дувана отпорног на хербициде
Прво успешно тестирање у пољу ГМ памука отпорног на хербициде
Администрација за храну и лекове (FDA, U. S. Food and Drug Administration) одлучује да ће ГМ храна
бити регулисана исто као и конвенционална храна
Парадајз са продуженом свежином (FlavrSavr Tomato) постаје прва ГМ биљка која је добила
одобрење за продају
Направљени ГМ канола и кукуруз отпорни на хербициде
У Америци је одобрен низ ГМ биљака отпорних на хербициде, инсекте или вирусе, попут памука,
соје, шећерне репе, кукуруза, папаје, кромпира, спанаћа, тиквица и парадајза
Континуирано тестирање и побољшавање „Златног пиринча“(Golden rice), модификованог да у
зрнима акумулира β-каротен
Примене биотехнологије
(подела на области)
Боја
Области биотехнологије
Црвена
Здравље, медицина, дијагностика, фармација
Жута
Прехрамбена биотехнологија и нутриционизам
Плава
Биотехнологија морских, водених и обалских система; аквакулт.
Зелена
Биотехнологија биљака, агрикултура и заштита живорне средине
Браон
Биотехнологија сушних подручја и пустиња
Тамна
Биолошко оружје, биотероризам
Розе
Патенти, проналасци, публикације, интелектуална својина
Бела
Биоиндустрија
Златна
Биоинформатика и нанобиотехнологија
Сива
Класична технологија ферментације и процесовања
Типови особина које се уводе у биљке

Улазне или произвођачке особине (input traits)






Излазне или потрошачке особине (output traits)






Отпорност биљака на хербициде
Отпорност на инсекте
Отпорност на патогене (биотички стрес): бактерије, гљивице, вируси, нематоде
Отпорност на абиотички стрес
Повећање приноса
Нутриционистички унапређене биљке
Биљке побољшаног укуса
Трајније воће и поврће са бољим карактеристикама сазревања
Дуван без никотина
Украсно цвеће нових боја, мириса и продужене свежине итд.
Посебне особине (value-added traits)





Терапеутски протеини који се користе у третирању болести или као вакцине
Секундарни метаболити
Текстилна влакна
Биоразградљива пластика
Уља која се користе за боје, детерџенте и лубриканте.
Проценат усева у УСА који су
генетички модификовани (2001)
80
% ГМ усева од укупних усева
70
60
69
68
55
50
40
30
26
20
10
0
памук
соја
канола
кукуруз
71% отпорност на хербициде
 28% отпорност на инсекте
 1 % све остале особине

Отпорност на хербицид глуфозинат
ADP
NH4+
H+
O
-
O
O
O-
O
O
O
O
ADP
NH3+
P
-O
O
O
-O
P
O
NH3+
Oγ-глутамил фосфат
интермедијер
Oглутамат
NH3+
NH3
O-
P
P
NH3+
H+, Pi
O
NH3+
Oтетрахедрални интермедијер
(транзиционо стање)
O
-O
Пептидаза
P
NH2
O
Oглутамин
O
-O
Фосфинотрицин
ацетилтрансфераза
P
O
O
CoA
O
2Ala
O
NH3+
HO
HN
HN
O
Фосфинотрицил-аланил-аланин
O
CH3COSCoA
NH3+
Oфосфинотрицин
(глуфозинат)
O
N
H
Oацетилфосфинотрицин
(неактиван)
Купус (B. oleracea var.
sabauda L.) трансформисан
bar геном (bialophos resistance
gene) помоћу A. tumefaciens
AGL1/pDM805.
а - Култура
нетрансформисаних (лево) и
трансформисаних изданака
(десно) на селективном
медијуму са 10 mg dm-3 L-PPT.
б - Трансформисане биљке
(десно) и конролне (лево)
после прскања са10 cm3 dm3 Basta®. Слика преузета из
Sretenović-Rajičić et al. (2004),
Отпорност на инсекте (ВТ токсин)
плазмид
протеолитичка активација
трансформација
N
I
НII
III
C
III
Bacillus thuringiensis
спорулација
I
спора
параспорално
тело
кристали ВТ
активан
ВТ токсин
II
инсерција
у мембрану и
олигомеризација
R
Инсекти осетљиви на ВТ:
а- кукурузов мољац (Ostrinia nubilalis);
б-памукова совица (Helicoverpa armigera);
в- Монарх лептир (Danaus plexippus).
www.agbios.com/dbase.php
Генетско инжењерство
Генетичко инжињерство, познато и као молекуларно клонирање,
генетска манипулација, технологија рекомбинантне ДНК, па чак и
нао „нова генетика“, представља област биотехнологије у којој се
гени и природне ДНК секвенце користе као ресурси којима се на
различите начине манипулише да би се постигли одређени циљеви
како у фундаменталним истраживањима, тако и у примењеним
областима.
РЕСУРСИ –
гени и природне ДНК
секвенце
АЛАТИ –
ензими
Основни кораци у ген. инжињерству
•Изолација гена од интереса
•Модификација гена од интереса
•конструкција генске касете
•Конструкција вектора и инсерција гена у вектор
•Трансформација
•Селекција - сепарација ГМ организама од нетрансформисаних организама
Изворни организам
Agrobacterium
Трансформација
Биљна ћелија
Изолација ГОИ
Генска касета
Вектор (плазмид)
Трансформисана биљна ћелија
Култура биљних ћелија/ткива
+ Селекција
Регенерација
Модификација
ГОИ
Аклиматизација
Еукариотски гени и регулација експресије
(подсетник)
Епигенетски ф. - модификација хроматина:
Ремоделовање хроматина
Модификације хистона
Метилација ДНК
Регулација транскрипције гена
Посттранскрипциони процеси у једру:
3’-полиаденилација
додавење m7G „шеширића“
Обрада: splicing /alternative splicing
Обрт (turnover) РНК
Транспорт у цитоплазму
Посттранскрипциони процеси у цитоплазми:
Обрт - разградња РНК
PTGS – посттранскрипционо утишавање
Едитовање РНК
Ефикасност транслације
Посттранслациони процеси
Успостављање конформације протеина
Ензимске модификације
Транспорт и локализација протеина
Протеин-протеин интеракције
Стабилност/разградња протеина
Генске касете
Промотор
Ген од интереса
Терминатор
Вектор
Промотори могу бити хомологни (из исте врсте, истог рода или евентуално исте
фамилије) или хетерологни (из удаљених врста)
Промотори који се користе у генетичком инжињерству биљака се деле на:
•Конститутивни промотори
•Промотори биљних патогена
•Конститутивни промотори монокотила
•Индуцибилни промотори
•Промотори индуковани абиотичким и биотичким стресом
•Хемијски индуковани промотори
CaMV 35S
•Ткивно-специфични промотори
промотор
•Развојно-специфични промотори
•Синтетички или рекомбинантни
Генске касете
Сигнална
Промотор секвенца?Ген од интереса
Терминатор
Органела
Ендоплазматични
ретикулум
Сигнал
HDEL/KDEL/RDEL
мотив
Напомена
Обично на С-терминусу
Вакуола
LQRD секвенца
Нуклеус
NSL
(nuclear
localization signal)
Понекад није довољна само ова секвенца, већ и
одговарајућа конформација да би се сигналне
секвенце довеле на површину протеина
Обично мали регион било где у протеину богат
базним амино киселинама. Није конзервативан. Неки
протеини имају и сигнал за експорт из једра, па могу
улазити и излазити.
Пероксизоми/
глиоксизоми
Хлоропласт
SKL мотив
(S/A/C)(K/R/H)L
N-терминални
транзитни пептид
Митохондрија
N-терминални
транзитни пептид
Варира, није конзервативан, али је обично богат
серином и треонином и нема киселих амино
киселина. Протеолитички се одстрањује после
транспорта.
Варијабилан, али има неких региона хомологије код
разних протеина. Обично нема киселих амино
киселина. Протеолитички се одстрањује после
транспорта.
Модификације хетерологних гена
Промотор
Ген од интереса
Терминатор
Хетерологни гени, а посебно гени који не воде порекло од биљака, се често веома
слабо експримирају у биљкама чак и кад су под контролом јаког промотора.
•Промена GC састава - бактеријски гени имају знатно нижи % GC од других. Висок %
АТ трансгена интерферира са процесовањем РНК у биљкама, јер су код биљака
региони богати са АТ обично интрони. Због тога се овакви трансгени слабо или
никако не експримирају у биљци
•Уклањање криптичних (скривених) интрона - секвенце трансгена које заправо нису
интрони, али их биљни системи за обраду РНК погрешно препознају као интроне и
исецају их. Ово доводи до делеција у транскрипту трансгена који се у том случају не
експримира.
•Уклањање АТТТА секвенци - код биљака поновци АТТТА односно AUUUA у
транскриптима смањују стабилност mRNA
•Уклањање потенцијалних места за полиаденилацију –бактеријски гени често имају
секвенце које биљни системи препознају као сигнале за полиаденилацију у сред
транскрипта. Ове секвенце, наравно, прекидају транскрипцију и неопходно их је све
уклонити осим једне на крају транскрипта.
•Оптимизација коришћења кодона
•Консензусне секвенце у околини AUG кодона неопходне за иницијацију
транслације су другачије код биљака него код других врста.
Нуклеазе
Нуклеазе се према типу супстрата и начину деловања класификују на следећи начин:
Егзонуклеазе (одвајају у главном по један по један нуклеотид са 3’ и/или са 5’ краја ланца)
Егзодезоксирибонуклеазе: λ егзонуклеаза, егзонуклеазе I, III и VII, BAL 31
Егзорибонуклеазе
Ендонуклеазе (секу у средини ланца)
Ендодезоксирибонуклеазе: BAL 31 , DNAse I, рестрикционе ендонуклеазе, nicking
ендонуклеазе
Ендорибонуклеазе: RNAse H, RNAse A, RNAse T1
Неспецифичне дезокси- или рибо- могу да секу и ДНК и РНК: нуклеаза S1, mung bean
нуклеаза, микрококална нуклеаза
G
A
H
H
O
5'
-2
O3P
O
P
O
H(OH)
3'
H
OO
H
3'-O-P
5'
O-
O
P
O
H
H
O
H(OH)
H
H
O
3'
OH
O
5'-O-P
5’-pNpN↓pNpNpNpN↓pNpN-OH3’  pNpN-OH + pNpNpNpN-OH + pNpN-OH
5’-pNpNp↓NpNpNpNp↓NpN-OH3’  pNpNp + HO-NpNpNpNp + HO-NpN-OH
Нуклеазе
Примена
Уклањање хромозомалне ДНК из препарација плазмида
Секвенцирање: генерисање ssDNA од dsDNA
Нуклеаза
λ егзонуклеаза
λ егзонуклеаза,
Егзонуклеаза III
PCR: уклањање прајмера после реакције
Егзонуклеаза I,
Егзонуклеаза VII
Увођење делеција на једном крају ДНК
Егзонуклеаза III
Скраћивање ДНК фрагмената
BAL 31
Помоћ у рестрикционом мапирању
BAL 31
Мапирање секундарне структуре ДНК
BAL 31
Уклањање ДНК из препарата РНК
DNAseI
DNA footprinting
DNAseI
Увођење једноланчаних прекида
DNAseI,
nicking ендонуклеазе
RT: деградација РНК матрице из mRNA:cDNA хибрида
RNAse H
Уклањање poly(A) репа из mRNA:poly(dT) хибрида
RNAse H
Мапирање тачкастих мутација
RNAse A
Уклањање нехибридизованих делова РНК из ДНК:РНК и РНК:РНК RNAse A,
хибрида
RNAse T1
Анализа ДНК:РНК хибрида
Нуклеаза S1
mung bean нуклеаза
Поравњавање 3' и 5' једноланчаних крајева на ДНК
Нуклеаза S1
Поравњавање 5' једноланчаних крајева на ДНК
mung bean нуклеаза
Уклањање нуклеинских киселина из препарата протеина
микрококална нуклеаза
Анализа хроматина
микрококална нуклеаза
Рестрикционо/модификациони системи
Рестрикционо/модификациони (Р/М) системи укључују рестрикциону
ендонуклеазу (РЕ, REase) и модификујући ензим- ДНК метилазу одн.
метилтрансферазу (MTase).
Додате метил групе залазе у велики жљеб ДНК, чиме спречавају везивање РЕ.
РЕ су нађени искључиво код прокариота (и код неких вируса), и то код свих испитиваних
бактерија и архебактерија
На основу композиције субјединица, места сечења ДНК, специфичности за секвенце и
захтева за кофакторима, РЕ се класификују у 4 типа:
Тип I - метилаза и РЕ су један комплексан ензим
Тип II - метилаза и РЕ се независни једноставни ензими (дели се на 11 подтипова)
Тип III - метилаза и РЕ су један комплексан ензим
Тип IV - само РЕ који сече страну метиловану ДНК
Солитарне метилазе (без РЕ парњака) немају везе са Р/М системима, али њихова
метилација може да интерферира са рестрикцијом
m5C- 5-метилцитозин
hm5C- 5-хидроксиметилцитозин
m4C- N4- метилцитозин и
m6A- N6-метиладенин
Рестрикционо/модификациони системи:
номенклатура
Род
Escherichia
Врста
coli
Сој/серотип/изолат
RY 13 (R. N. Yoshimori)
први РЕ из
тог соја
рестрикциони
ензим
EcoRI = R.EcoRI
М.EcoRI
RМ.Eco57I
S.EcoR12I
C.EcoRV
метилаза
ензим има и
рестрикциону и
метилазну
активност
RE типа I имају
одвојену
субјединицу
за специфичности
за неке RE постоје
контролни протеини
за рег. експресије
ecoRIR
ecoRIM
R/M системи типа II: специфично место препознавања и
константно место сечења
Главне карактеристике
Пример
Место препознавања
Асиметрично место*. Обухватају све РЕ који препознају
асиметричне секвенце, чак и ако они припадају другим
подтиповима. Овим РЕ обично припадају две метилазе- по
једна за сваки ланац асиметричне секвенце, које могу
бити фузионисане
Сече са обе (both) стране места, оба ланца, тако да се
добија и мали фрагмент који садржи место препознавања.
РЕ и М гени фузионисани
Симетрично или асиметрично место;
РЕ и М су један полипептид-фузионисани (combined). Овај
подтип обухвата све ензиме подтипа IIB, IIG и неке IIH.
Интерагују са две копије места: једно се сече, а друго је
алостерични ефектор
FokI
AciI
GGATG (9/13)#
CCGC(-3/-1)
BcgI
(10/12)CGANNNNNNTGC(12/10)
GsuI
HaeIV
BcgI
EcoRII
NaeI
CTGGAG(16/14)
(7/13)GAYNNNNNRTC(14/9)¥
(10/12)CGANNNNNNTGC(12/10)
↓CCWGG
GCC↓GGC
F
Два места (копије)- оба се секу координисано
G
Симетрично или асиметрично место.
S-аденозилметионин утиче на активност;
РЕ и М гени фузионисани
Симетрично или асиметрично место.
Структура гена слична као код Типа I (Hsd), али се
биохемијски понашају као тип II
Симетрично или асиметрично место.
Захтевају метиловано место.
Симетрично место препознавања и сечења (палиндром).
Хомодимери, први откривени и највише коришћени,
комерцијализовани
SfiI
SgrAI
BsgI
Eco57I
GGCCNNNN↓NGGCC
CR↓CCGGYG
GTGCAG(16/14)
CTGAAG(16/14)
BcgI
AhdI
(10/12)CGANNNNNNTGC(12/10)
GACNNN↓NNGTC
DpnI
Gm6A↓TC
EcoRI
PpuMI
BslI
NlaIII
FokI
MmeI
G↓AATTC
RG↓GWCCY
CCNNNNN↓NNGG
CATG↓
GGATG (9/13)
TCCRAC(20/18)
Bpu10I
BslI
CCTNAGC(-5/-2) #
CCNNNNN↓NNGG
A
B
C
E
H
M
P
S
T
Асиметрично место препознавања и асиметрична
секвенца која се сече, која је изван места препознавања
(shifted); сви спадају и у подтип IIA. Имају два доменаједан за специфичност везивања и други каталитички
Симетрично или асиметрично место.
Хетеродимери.
R/M системи типа II – важне ствари
До сада откривено преко 3500 ових ензима.
Како се откривају?
Једноставан есеј:
свака ензимска активност која даје
константну шему фрагментације одређене
ДНК је по дефиницији РЕ типа II.
BamHI (5’ крајеви)
5'---G GATCC---3‘
3'---CCTAG G---5'
Континуално или
дисконтинуално
место препознавања
BglII (5’ крајеви)
KpnI (3’ крајеви)
5'---A GATCT---3‘
3'---TCTAG A---5'
5'---GGTAC C---3‘
3'---C CATGG---5'
SmaI (равни крајеви)
5'---CCC
3'---GGG
GGG---3‘
CCC---5'
Дужина места препознавања је важна при избору РЕ, јер од дужине зависи фреквенција
рестрикције
Изошизомери су два или више РЕ који препознају и секу исту секвенцу:
HpaII (C↓CGG) и MspI (C↓CGG)
Неошизомер препознаје исту секвенцу као прототип али је сече другачије:
AatII (GACGT↓C) и ZraI (GAC↓GTC)
R/M системи типа II – примене
Рестрикциона фрагментација (restriction digest) је једна од основних
процедура у молекуларној биологији, која се користи да би се геномска
или друга ДНК припремила за анализу или неку другу обраду. Ако се два РЕ
користе симултано, то је double digest. Делимична фрагментација је partial
digest. У оквиру метода: Southern хибридизација, анализе молекуларних
маркера типа RFLP, AFLP и VNTR и др.
Анализа генотипа- РЕ се могу користити за разликовање генских алела јер
могу да препознају промене у појединачним базама (Single Nucleotide
Polymorphysms, SNPs)
Молекуларно клонирање
Рестрикционо мапирање представља одређивање места познатих РЕ у
некој ДНК секвенци. Рестрикционе мапе се потом користе као референца
током конструкције плазмида или других вектора и генских конструката,
за одређивање оријентације инсерта у вектору и друге апликације.
ДНК и РНК лигазе
ДНК лигазе катализују формирање фосфодиестарских веза на месту једноланчаних или
дволанчаних прекида у дуплексу ДНК.
Лигазе су много ефикасније у повезивању кохезивних крајева
Присуство фосфатне групе на 5' крају ланца је предуслов за реакцију (Т4 полинуклеотид
киназа/алкалном фосфатаза)
Према типу супстрата и кофактора, лигазе нуклеинских киселина се деле на три групе:
АТР-зависне ДНК лигазе
NAD+-зависне ДНК лигазе
АТР-зависне РНК лигазе
ДНК и РНК лигазе
Примена
Повезивање кохезивних крајева ДНК при клонирању
Повезивање равних крајева ДНК при клонирању
Качење адаптера и линкера на ДНК равних крајева
Поправка једноланчаних прекида у dsDNA
Поправка једноланчаних прекида у dsRNA
Повезивање РНК и ДНК у дволанчану структуру
Обележавање 3'-крајева РНК
Повезивање једноланчаних нуклеотида ДНК или РНК
Реакција детекције лигазом (Ligase Detection Reaction);
Ланчана реакција лигазе (Ligase Chain Reaction)
Клонирање microRNAs
Лигаза
Т4 ДНК лигаза
E. coli ДНК лигаза
(Taq ДНК лигаза)
(9oN ДНК лигаза)
Т4 ДНК лигаза
Т4 ДНК лигаза
Т4 ДНК лигаза
E. coli ДНК лигаза
Taq ДНК лигаза
9oN ДНК лигаза
Т4 РНК лигаза 2
Т4 ДНК лигаза
Т4 РНК лигаза 2
Т4 РНК лигаза 1
Т4 РНК лигаза 1
Taq ДНК лигаза
9oN ДНК лигаза
Т4 РНК лигаза 2 (1-249)
Лигација инсерта у вектор
Жељени продукт je фрагмент убачен у вектор, који се добија бимолекуларном
конкатемеризацијом.
Циркуларизован вектор без инсерта
Повезани сами вектори
Повезани сами инсерти
Полимеризација ДНК (подсетник)
5'3' полимеризна активност
Полимеразе
Полимеразе су ензими чија је улога полимеризација нуклеинских киселина уграђивањем
нуклеотида које у форми NTPa одн. dNTPa узимају из раствора, при чему се ослобађа
пирофосфат (PPi). Полимеразе се по функцији и типу матрице деле на:
•ДНК полимеразе: полимеризација ДНК на основу ДНК мартице. Деле се на репликативне и
„repair” полимеразе.
•Реверзне транскриптазе катализују полимеризацију ДНК на основу РНК мартице;
кодиране ретровирусима
•Терминална трансфераза: полимеризација ДНК продуживањем 3'-крајева
•РНК полимеразе - транскрипција. Незахвалне за експериментално коришћење
(промотори, транскрипциони фактори...), осим у саставу китова за in vitro транскрипцију.
•РНК-зависне РНК полимеразе
Заједничке карактеристике полимераза:
Полимеризација се увек одвија у 5’3’ правцу, тј. нуклеотиди се додају на 3'-крај
За полимеризацију је неопходан слободан 3'-ОН терминус
За полимеризацију је неопходна матрица. Ни једна ДНК полимераза не може да започне de
novo синтезу ДНК. Ни једна ДНК полимераза (осим терминалне трансферазе) као матрицу
не може да користи интактну дволанчану ДНК, већ само:
једноланчану ДНК са хибридизованим олигонуклеотидом - прајмером.
дволанчану ДНК са краћим или дужим прекидима једног ланца (gaps) или
дволанчану ДНК којој штрчи 5' крај
дволанчану ДНК са једноланчаним прекидима (nicks)- само у случају неких полимераза
као што је E. coli ДНК полимераза I и њен Klenow фрагмент
Неопходни су dNTPs
Mg2+ јони су неопходни за све полимеразе.
Битне особине по којима
ДНК полимеразе
разликују су:
5'3' се
полимеризна
активност
Тачност (fidelity)
Брзина (бр уграђених нуклеотида/s)
Процесивност (бр уграђених нуклеотида пре дисоцијације од матрице)
Матрица - за већину ДНК полимераза је ДНК, а за реверзне транскриптазе је РНК
3’5’ егзонуклеазна активност (proofreading)
5’3’ егзонуклеазна активност (nick translation)
Замена ланца (strand displacement)
Термостабилност зависи од типа организма из којих је ензим изолован (мезофилни,
термофили, хипертермофили)
5’3’ егзонуклеазна активност
се користи за методу померања прекида
(Nick translation),
3’5’
егзонуклеазана
активност је
пожељнa за highfidelity PCR,
уклањање 3'крајева који штрче
и синтезу другог
ланца, а
непожељна је за
уградњу
нестандардних,
модификованим
или обележених
нуклеотида
Замена ланца (strand displacement) је способност
полимераза којима недостаје 5’3’ егзо да одлепе један
ланац од другог. Ово је корисно за изотермалну
амплификацију (Strand Displacement Amplification, SDA)
3’5’
егзо
5’3’
егзо
Замена
ланца
Фрекв.
грешака
х10-6
Термостабилност
E. coli ДНК пол I
+
+
-
9
-
E. coli ДНК пол I
Klenow фраг.
+
-
+
18
-
E. coli ДНК пол I
Klenow фраг. 3’5’ еxo-
-
-
+
100
-
T4 ДНК пол.
+
-
-
1
-
T7 ДНК пол.
+
-
-
15
-
Sequenase
-
-
+
-
φ29 пол.
Bst ДНК пол.
Bst ДНК пол.
Велики фрагмент
+
-
+
++
-
+/-
-
-
+
+/-
Taq ДНК пол I
-
+
-
Pfu ДНК пол
+
-
VentR® пол.
+
-
Deep VentR®
+
-
Полимераза
285
+
1.6
+
+
57
+
+
20-45
+
0.44
+
PhusionTM
9°Nm ДНК пол.
+
-
+
+
TherminatorTM
-
-
+
+
Примена
Nick транслација
Синтеза 2. Ланца
Обележавање 3' крајева
Секвенцирање Поравњавање
крајева
Обележавање 3' крајева
Синтеза 2. ланца
Секвенцирање
Синтеза 2. ланца
Обележавање ДНК насумичним
прајмерима
Попуњавање прекида
Поравњавање крајева
Синтеза 2. ланца
Радиоак. обележавање
Копирање дужих сегмената ДНК
Синтеза 2. ланца
Попуњавање прекида
Секвенцирање
Изотермална амплификација
/
Секвенцирање: код GC-богатих
региона и малих количина узорка
PCR
Високопроцесивни PCR
Екстензија прајмера
Флуор. обележавање
Nick транслација
PCR високе тачности
PCR високе тачности
Екстензија прајмера
PCR високе тачности
Екстензија прајмера
PCR високе тачности
PCR- дугачки ампликони
клонирање
Екстензија прајмера
SNP анализа
Уграђивање модификованих нукл.
Klenow фрагмент
Остали ензими
Т4 полинуклеотид киназа катализује трансфер γ-фосфатне групе АТР-а на 5'-крај ДНК
или РНК, па се користи за фосфорилацију 5'-крајева ако им недостаје фосфатна група,
што је предуслов за лигацију. Може се користити и за радиоактивно обележавање крајева
нуклеинских киселина ако се као супстрат користи [γ-32Р]АТР
Алкалне фосфатазе су Zn2+-металоензими који су најактивнији на рН 8-9, а катализују
уклањање 5'-фосфтане групе са ДНК, РНК, rNTP-a и dNTP-a.
Системи специфичне рекомбинације (site-specific recombination systems) су
изоловани из вируса и бактериофага који могу да се интегрушу у геном домаћина у
форми профага, где катализују интеграцију виралног генома и његово извлачење
(excision). Ови системи имају широку примену у биотехнологи, а се састоје од ензима
рекомбиназе и специфичне секвенце коју дата рекомбиназа препознаје и на коју делује.
Од оваквих система се највише користе Cre/Lox, Flp/FRT, R/RS и Int/att.
Биотехнологија и генетичко
инжењерство биљака - 2. предавање
•
•
•
Вектори
•
Плазмиди
•
Бактериофази
•
Хибридни вектори великог капацитета и вештачки хромозоми
Трансформација
•
Agrobacterium tumefaciens и природна трансформација биљака
•
Експлоатација A. tumefaciens: бинарни вектори
•
Трансформација помоћу Agrobacterium rhizogenes
•
Хемијска трансформација
•
Електропорација
•
Биолистичка трансформација
Селекција
•
Типови селектабилних маркера
•
Негативна селекција: резистенција на антибиотике и хербициде
•
Позитивна селекција
•
Визуелна селекција: лактозни оперон и α-комплементација
•
Репортер гени и генске фузије
Вектори
Вектори за клонирање су ДНК молекули који се користе за транспорт
клонираних секвенци између различитих домаћина (бактеријских и
биљних ћелија) и епрувете и за конструкцију геномских и cDNA
библиотека. Сви лабораторијски и комерцијални вектори морају да
имају следеће особине:

Могућност аутономне репликације

Имају генетички маркер (или маркере) за селекцију

Јединствена рестрикциона места за различите рестрикционе ензиме

Имају минималну количину неесенцијалне ДНК.
Вектор
Капацитет (Kb)
Домаћин
Ti плазмид/ бинарни вектор
Ri плазмид/бинарни вектор
Остали плазмиди
λ фаг
Козмиди
Фозмиди
Р1
PAC
BAC
YAC
5-10 (max 20)
A. tumefaciens
A. rhizogenes
20
35-45
45
70-100
130-150
150-350
250-500 (max 1 Mb)
Бр. копија
велики
E. coli
1
Квасац
Плазмиди







Плазмиди су екстрахромозомални молекули ДНК величине 1-200 Kbp,
Налазе у бактеријама домаћинима у циркуларној, суперхеликалној форми
Репликација и наслеђивање независно од бактеријског хромозома
Већина има узак избор домаћина - бактерија
Зависни од домаћина у мањој или већој мери – бактерија кодира ензиме и протеине
неопходне за репликацију и транскрипцију
Одржавају сталан број копија; имају механизме за поделу одређеног бр. плазмида
ћеркама ћелијама, као и механизме заштите од других плазмида. Репликон је генетичка
јединица која се која се састоји од места почетка репликације (Origin of Relication, ORI) и
контролних елемената. Репликон плазмида се дефинише и као сегмент плазмидне ДНК
који може аутономно да се умножава и одржава сталан број копија.
Често садрже гене који користе домаћину:





Резистенција на антибиотике
Продукција антибиотика
Деградација комплексни органски молекула
Продукција токсина – колицин, ентеротоксин и др
Продукција рестрикционих и модификационих ензима
Шта све пристојан лабораторијски
плазмид треба да има?

ОБАВЕЗНО:

Репликон и ORI
Полилинкер место за клонирање
(Polylinker Cloning Sites or Multiple
Cloning Sites – MCS).
Селектабилни маркер(и)







ОПЦИОНАЛНО:
Репортер ген
LacZa - 5'-крај гена за β-галактозидазу
Експресиони вектори имају и прокариотске промоторе (обично из
бактериофага T3, T4 или SP6), као и друге неопходне прокариотске 5'регулаторне секвенце, као што је Shine-Dalgarno секвенца
Елементи М13 фага који омогућавају репликацију једноланчане ДНК
Типови плазмида




У генетском инжењерству се
користи 3 типа плазмида:
Вирулентни плазмиди – кодирају за
бактеријске токсине као што су
колицини
Плазмиди који носе резистенцију на
антибиотике
Коњугативни плазмиди:


F плазмид, F фактор или ЕПИЗОМ:
 Омогућава бактерији да продукује
секс пилус за коњугацију
 Велики, 1 копија
 Користе се као основа за
конструкцију фозмида и ВАСK
 За везивање M13
 F+ бактерије га имају
 F- бактерије га немају
 F’ бактерије имају у њему и додатну,
бактеријску ДНК
 Hfr бактерије имају F интегрисан у
геном
Ti и Ri Плазмиди – за трансформацију
биљака
F+ cell
F- cell
F pl
F+ cell
F+ cell
Стратегија клонирања плазмидима
1. RE дигестија ДНК и плазмида
2. Лигација
3. Трансформација E. coli
4.Селекција
5. Раст бак-
6. Лиза ћелија
7. Изолација
плазмида
Типови бактериофага
Тип
геном
особине
T серија (T4, T7) Велики,
линеарни
Парни и
непарни
dsDNA
Само литички циклус.
Користе се ензими
лигазе и полимеразе,
као и промотори
Умерени
, P1
Линеарна
dsDNA
Литички и
лизогени циклус
Мали
сферични
ΦX174, Φ29
Циркуларна
ssDNA
Ензими...
Мали
циркуларна
филаментозни ssDNA
M13, fd, f1
РНК
ssRNA
бактериофази
За продукцију
једноланчаних
ДНК матрица
сликица
Бактериофаг ʎ
• ʎ фаг је један од најбитнији модел
организама и алата у генетском инжењерству
•Геном ʎ је dsDNA, линеарна док је спакована у
главе фага, 48.5 Kb, око 30 гена
•Крајеви су једноланчани, кохезивни (12 nt) и
зову се se cos места.Кад уђе у домаћина,
крајеви се залепе и долази до
циркуларизације
PL
PRM
PR
Глава
PRE
PI
attP
30% генома
може да се
замени

Реп
(135 nm)
48502 bp
PR’
PantiQ
Конични део
(15 nm) и
репна нит
(23 nm)
Литички и
лизогени
циклус ʎ
Регулација литичког и
лизогеног циклуса је веома
комплексна, али се у
суштини све своди на то
који ће од два главна
регулаторна гена
„преовладати“: cro 
литички циклус или cI 
лизогени циклус, што
зависи од услова раста
бактерија, да ли је ћелија
под стресом и да ли је
дошло до оштећења ДНК.
Бактеријски
хромозом
E. coli
Везивање фага
за бактерију
и ињектирање
λ ДНК
Циркуларизација
λ ДНК
Синтеза
виралних
протеина
Интеграција
Репликација
λ ДНК и
паковање
Индукција
Пролиферација
Лиза
Профаг
Лизогени циклус
Литички циклус
Репликација и паковање ʎ
Коришћење у генетском инжењерству
cos L:
5’pGGGCGGCGACCT
Инфекција
cos R:
5’pCCCGCCGCTGGA
λ ДНК (48.5 Kbp)
cos
ori
E. Coli ДНК лигаза
циркуларизација
cos
Репликација
θ механизмом
cos
Конкатемерна ДНК
cos
Репликација
механизмом
котрљајућег
обруча
Исецање терминазом
паковање
Рекомбинантна ДНК (78-105% WT λ )
Лигација
cos лева рука
странa ДНК
15-20 Kbp
десна рука cos
Коришћење
λ фага
као вектора
за клонирање
Зашто је λ фаг добар вектор?





λ може да прими велике инсерте ДНК. Око 15 Kbp, што је скоро трећина
генома, може да се исече из централног дела, између гена J и N, и
замени са 15-20 Kbp стране ДНК без утицаја на литички циклус. Међутим,
величина ДНК која може да се спакује у главу фага је фиксна и износи
78 - 105 % WT генома. Ако је величина ДНК изван ових граница, паковање
је неефикасно, или је виталност и инфективност вируса ниска.
Много је година и рада уложено у проучавање λ и његове модификације,
па постоји цела палета исконструисаних верзија овог вируса.
Комерцијални λ обично имају уграђено пуњење од ≈ 15 Kbp (stuffer
fragment) које се замењује страном ДНК, па се називају и
супституционим векторима.
λ је један од неколико организама који могу бити реконституисани у
епрувети (in vitro packaging), тако да је могуће једноставно помешати
рекомбинантну ДНК са протеинима за главу и реп и инфективне честице
ће се саме оформити. Постоје и готови китови за паковање, као што су
Gigapack® (Stratagene) i Packagene® (Promega).
Трансформација је знатно ефикаснија у поређењу са
трансформацијом плазмидима
λ фаг се, осим као вектор, користи и као извор низа других елемената и
алата за генетичко инжињерство. Сos места и протеини главе и репа се
комбинују са другим векторима при конструкцији хибридних вектора.
Посебно се користе и ензими кодирани λ фагом, као λ егзонуклеаза.
Бактериофаг М13
•
•
Филаментозни фаг, не доводи до лизе ћелије. Има 11 гена (pI - pXI)
Користи се за прављење ss копија DNA, матрица за место-специфичну
мутагенезу, секвенцирање, специфичних проба, у нанотехнологији и др.
pVII+pIX
pVIII
pIII
pVI
pV
1 - Везивање фага за
F-пилус
1
2 – инфекција
3 - репликација θструктуром
4 - транскрипција
виралних гена
5 - репликација типа
котрљајућег обруча и
исецање нових
једноланчаних
генома
6 – циркуларизација
7 - ssDNA/pV
комплекс
8 - паковање и
излазак из ћелије.
8
Спољна мем.
Унутрашња мем.
F1
2
7
4
5
3
+ssDNA
pII, pX
θ реплик.
pII, pX
+
-
Касна фаза
(конц. pV висока)
+ssDNA
потомство
6
Рана фаза
(конц. pV ниска)
Хибридни вектори



Козмиди (cosmids) су плазмиди са cos местима
λ фага. Као и плазмиди, имају ORI, MCS и
селектабилни маркер. Козмиди се у бактерији
размножавају као велики плазмиди, јер немају
гене за литички циклус, али се због cos места
могу спаковати in vitro у вирусне честице, што
олакшава трансформацију. Величина је до 50
Kbp, а капацитет је 35-45 Kbp
Фозмиди (fosmids) су слични козмидима и имају
cos места, али су базирани на F-плазмиду.
Капацитет фозмида је као и код козмида око 45
Kbp, а величине су до 50 Kbp.Као и F-плазмид,
одржавају само једну копију по ћелији.
Фагемиди или фазмиди (phagemids, phasmids)
представљају комбинацију између
филаментозног фага (М13 или f1) и плазмида.
Ови вектори имају један плазмидни ORI, обично
типа ColE1, да би могли да се разможавају у
виду дволанчане ДНК као плазмиди, али и
интергенски регион из f1 или М13 (f1 ORI), који
омогућава умножавање у форми једноланчане
ДНК и потом паковање у вирусне честице.
BAC – Bacterial Artificial Chromosomes


Базирани на F-фактору (плазмиду)
Примају у просеку 120 kB, али може до 300 kB







САТ- селектабилни маркеррезистенција на хлорамфеникол
oriS, repE, IncC – компоненте
репликона из F-фактора –
стриктна контрола броја копија
parA, parB, parC – гени за
партицију из F фактора који
омогућавају правилну поделу
после репликације између ћерки
ћелија
OriV – индуцибилни Ori, да се по
потеби повећа бр. копија
LacZа –за преглед путем комплементације
MCS
loxP i cos – олакшавају вађење
клониране секвенце
YAC – Yeast Artificial Chromosomes
Дигестија са
BamHI + EcoRI
Лева рука
EcoRI
Геномска
ДНК
(непотпуна
дигестија)
Десна рука
фрагменти
400 Kbp- 1 Mbp
Лигација
Трансформација квасца
Трансформација




Трансформација у ширем смислу подразумева сваки процес уноса
стране ДНК у ћелије домаћина, било у форми линеарног (рекомбинантног)
фрагмента или фрагмена убаченог у вектор, при чему долази до
инкорпорације стране ДНК у геном и експресије страног генетичког
материјала.
У ужем смислу трансформација не укључује унос стране ДНК путем
вируса или бактериофага, већ се овај процес назива трансдукција.
Коњугација – размена ДНК ћелијским контактом (нпр. путем F-плазмида)
Нуклеинске киселине не могу да уђу у бактеријске или еукариотске ћелије
саме од себе, већ им је за пролазак кроз спољашњу мембрану или
ћелијски зид и плазмамембрану потребна одговарајућа помоћ.
Методе трансформације

Биолошки или природни механизми




Хемијски методи



Унос гена у бактерије помоћу бактериофагних вектора
Унос гена у еукариотске ћелије вирусима (трансдукција)
Унос гена у биљне ћелије посредством A. tumefaciens и A. rhizogenes
Трансформација бактерија плазмидима (CaCl2/топлотни шок метод)
Трансформација протопласта огољеном ДНК (CaCl2/PEG метод)
Физички методи




Електропорација
Биолостичка трансформација
Трансформација силикон-карбидним влакнима
Микроињектирање
Agrobacterium tumefaciens – животни циклус



A.t. је земљишна бактерија која код дикотила узрокује туморе crown gall
Једини познат пример природног трансфера ДНК имеђу 2 царства
A.t себи стварају посебну еколошку нишу тиме што терају биљку да
производи ОПИНЕ – супстанце које само A.t може да користи
T-DNA (transferred DNA) садржи:
Граничнике LB i RB
Cyt– синтеза цитокинина
Aux– синтеза ауксина
nos – за синтезу нопалина (или ocs – за октопин)
Ostatak Ti plazmida sadrži:
O – overdrive (enhancer)
ORI
noc катаболизам нопалина (или occ –
катаболизам октопина)
Tra – за трансфер плазмида коњугацијом
Inc – за инкомпатибилност (имунитет на друге
плазмиде)
Vir region – geni za transfer T-DNA

Ti плазмид






Т-DNA





α-кетоглутарат
ОПИНИ су храна за
бактерију, извор N и
C, које производи
биљка.
Најпознатији су
НОПАЛИН, ОКТОПИН,
МАНОПИН и
АГРОПИН.
H
аргинин
COOH
COOH
C
N
C
CH2
H
CH
пируват
H
H
α-KG+Arg2 Pyr+Arg
аргинин
маноза
глутамин
COOH
COOH
COOH
C
N
C
CH3
H
CH2
HO
CH
H
H2C
N
C
H
CH2
CH2
CH2
CH2
HO
CH
CH2
COOH
CH2
CH2
HO
CH
C
NH
NH
HO
CH
HO
CH2
H2N
C
HN
нопалин
C
NH2
HN
октопин
NH2
манопин
H
O
COCH3
Трансфер
Биљни
геном
1а
Ацетосирингон
H3CO
OCH3
OH
chvE
Бактеријски 1б
хромозом
attR
chvE
5’
Р
D1
RB C1
O
Ti
А А
Р
Р
2
Синтеза 8
ауксина
цитокинина
опина
G
7
E2 E2 E2 E2 E2
D2
4
E2 E2 E2 E2 E2
F
Р D2
E3
1в
5
K-α
NTP
NTP
S
B4
B3
B6 B9
п.п.
S
B7
D4
NTP
B8
B9
B7
B11
B10 S
S
с.м. споља
B5
T-pilus
K-α
6
Vip1 E3 E3 Vip1Vip1
E2 E2 E2 E2 E2
E2 E2 E2 E2 E2
Vip1Vip1Vip1Vip1 E3
E2 E2 E2 E2 E2
м
Р D2
K-α
Vir
цитосол
F
Vip1 E3 E3 Vip1Vip1
E2 E2 E2 E2 E2
Vip1Vip1Vip1Vip1 E3
плазмид
3
Тумор
Катаболизам
опина
9
chvA
LB
А
Р G
chvB
pscA
А
Р D2
K-α
K-α
Биљна ћелија
B1
B2
B5
A. tumefaciens
- Vir протеини
- Биљни протеини
Р - Фосфатна група
- Опини
- Геномска ДНК
- Т-ДНК
LB- леви граничник
RB – десни граничник
O - енхенсер
м - плазмамембрана
п.п.- периплазматични простор
с.м. – спољашња мембрана
Систем бинарних вектора
Страни ген
и/или
репортер
Бинарни вектор
(Вештачки Ti плазмид
за трансформацију)
E. coli
A. tumefaciens
Разоружан
(помоћни)
Ti плазмид
биљна ћелија
Agrobacterium rhizogenes




Слична A. t., али има Ri (root inducing) плазмид
Индукује туморе у виду длакавих коренова
(hairy roots) који моду да расту и независно, у
култури без хормона
Из hairy roots се могу регенерисати целе
трансгене биљке
Примене A. rhizogenes, култура
трансформисаних коренова и регенераната :






Продукција секундарних метаболита
Продукција терапеутских протеина
Проучавање метаболичких путева и одговора
биљака на хемикалије
Експериментални систем за проучавање
интеракција са другим организмима, као што су
нематоде, микоризалне гљивице и патогени коренова.
Фиторемедијација (акумулација тешких метала)
Добијање трансгених биљака регенерацијом из
културе коренова
Хемијска трансформација
•
Хемијска трансформација бактерија плазмидима – ћелије могу да
постану КОМПЕТЕНТНЕ хлађењем у присуству двовалентних катјона,
после чега бактеријски зид постаје пропустљив за плазмидну ДНК.
После тога топлотни шок омогућава улазак ДНК у ћелију
Ресуспензија
бактеријског талога
у раствору CaCl2
Чување компетентних
ћелија на -80оС
центрифугирање
Аликвотирање
компетентних
ћелија
Хлађење на леду
Култура E. coli
у log фази
R
Плазмид
са геном за
резистенцију
на антибиотик
Засејавање
на подлози са
антибиотиком
106-108
колонија/μг ДНК
37оС
42оС
Водено купатило
•
Топлотни
шок
лед
Хемијска трансформација биљних протопласта. Протопласти се могу
учинити компетентним за трансформацију огољеном ДНК третманом
полиетилен гликолом у присуству двовалентних катјона - обично Ca²+.
Електропорација
•За бактерије, квасце и биљне протопласте
•Електрично поље повећава пермеабилност
мембране и може да направи привремене поре
•Важно је подесити параметре (V, t, фреквенцију) да
се ћелије не оштете и не убију.
•10 х ефективније од хемијског метода
Поновити
центрифугирање
и ресуспендовање
Ресуспензија
бактеријског талога
у стерилној
води
1
2
4
3
центрифугирање
Компетентне
ћелије
Хлађење на леду
Култура E. coli
у log фази
R
+
Плазмид
са геном за
резистенцију
на антибиотик
-
Засејавање
на подлози са
антибиотиком
108-1010
колонија/μг ДНК
Пуфер
Електрошок
лед
Биолистичка трансформација
(gene gun, particle bombardment)
Користе се честице од злата или волфрама обложене са ДНК
Примарно се користи за монокотиле
пиштољ
Прекидач
вакуум/
вентилација/
Окидач
пауза
Главни
прекидач
Цилиндар за
акцелерацију
гаса (Не)
Мерач
притиска
гаса
Диск за пропуштање
гаса (rupture disk)
Зауставни екран
Макроносач
Мерач
вакуума
Микроносачи
обложени
са ДНК
Зауставни екран
Селекција



Трансформацијом се нови гени уносе у само мали број ћелија, па је следећи
корак у генетичком инжињерству селекција трансформисаних ћелија међу
нетрансформисаним.
Селектабилни маркери су гени који се уводе у бактеријске или биљне ћелије
паралелно са геном од интереса, на истом вектору, а се користе за
селекцију трансформисаних организама и/или за праћење генске
експресије
Заједничка карактеристика селектабилних маркера и репортер гена је да
се њихова експресија може лако пратити.
Типови селектабилних маркера




Селектабилни маркери за негативну селекцију су гени који
успостављају резистенцију на антибиотике или хербициде. Ово је
традиционални тип вештачке селекције који се означава као негативна
селекција јер селектабилни агенс убија нетрансформисане ћелије.
Селектабилни маркери за позитивну селекцију су гени који
трансформантима омогућавају раст користећи супстанцу која је
селектабилни агенс (нпр. алтернативни извор угљеника), али
селектабилни агенс не убија нетрансформисане ћелије.
Маркери за визуелну селекцију омогућавају визуелно разликовање
трансформисаних и нетрансформисаних колонија или клонова, нпр.
према боји или морфологији, при чему селективни притисак не постоји.
Ови гени и нису селектабилни макери у стриктном смислу те речи, па
их је правилније означавати прегледним маркерима или маркерима за
сортирање (screenable markers).
Репортер гени су посебан тип маркера за визуелну селекцију чија се
експресија може квантификовати (scoreable markers).
Негативна селекција – резистенција






Резистенција на:
 Антибиотике
 Хербициде
 Токсине
 Антиметабилите
Природни извор гена за резистенцију на антибиотике су
бактеријски плазмиди и транспозони.
Поједини антибиотици су специфични само за прокариоте или,
рецимо, само за Грам-негативне бактерије, док су други
токсични и за прокариоте и за еукариоте.
Већина антибиотика инхибира синтезу протеина
Гени за резистенцију већином кодирају за ензиме који
модификују антибиотике нпр. фосфорилацијом или
ацетилацијом и тако их детоксификују, али има и случајева
када се резистенција заснива на избацивању антибиотика из
ћелије.
Ген за резистенцију се убацује заједно са геном од интереса у
бактерију или биљну ћелију и остаје у потомству (страх у
јавности од ГМО, да се резистенција не прошири на друге
организме)
Резистенција на антибиотике
OH
OH
Cl
Хлорамфеникол
H
N
Cl
O
O2N
NPT
ATP
Канамицин
HO
NH2
ADP
O
HO
OH
OH
O
CH3COSCoA
OH
O
NH2
HSCoA
O
H2N
NH2
OH
HO
R
C
H
Ампицилин (R=NH2)
Карбеницилин (R=COOH)
Тетрациклин
H3C
C
O
HO
NH
H
C
C
O
CH3
N
CH3
H
C
S
CH3
H
H
NH2
N
HOOC
H+
OH
C
CH3
H
OH
OH
O
OH
O
O
TET
Маркери за позитивну селекцију





Маркери за позитивну селекцију су нова генерација маркера
који се користе уместо гена за резистенцију. Трансформисане
ћелије добијају способност да метаболишу супстрате које
раније нису могле да користе, па зато брже расту, а
нетрансформисане споро или никако.
Селектабилни агенс НЕ УБИЈА нетрансформисане ћелије
Ензими који преводе неактиван биљни хормон у активну форму
Ензими који омогућавају коришћење алтернативних угљених
хидрата, необичних шећера и сл.
Фосфоманозо изомераза (PMI), пореклом из E. сoli, катализује
интерконверзију манозо-6-P у фруктозо-6-P. Само
трансформисане биљке са PMI могу да живе на медијуму са
манозом и користе је као извор С.
Маркери за визуелну селекцију
Маркери за визуелну селекцију (screening) омогућавају да се
трансформисани и нетрансформисани организми разликују, нпр.
по боји или по морфологији, али сви преживљавају.
Најпознатији тип визуелне селекције, α-комплементација (blue-white
screen) је базиран на лактозном оперону
Лактозни оперон
Промотор
Регулатор
Место
за САР
протеин
Промотор
и
оператор
β-Галактозидаза
Пермеаза
Трансацетилаза
Терминатор
R
P
Репресор
LacI
cap
P O
LacZ
LacY
R
Алолактоза
R
Алолактоза
Лактоза
Галактоза + глукоза
LacA
T
CH2OH
CH2OH
Физиолошка
реакција
O
OH
b
OH
O
OH
b-гал
OH
O
OH
Природни
индуктор
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
D-галактоза
D-глукоза
Алолактоза
(галактоза-(b16)-глукоза)
OH
OH
CH2OH
CH3
O
OH
+
S CH
CH3
OH
IPTG
(изопропил-b-D-тиогалактозид)
Cl
OH
O
H
N
CH2OH
Бојена
реакција
O
OH
Н2О D-гал.
Cl
HO
Br
Br
O2N
O
O
O2N
b-гал
HO
Н2О D-гал.
OH
О-нитрофенол
OH ONPG
(жуто)
Br
Br
H
N
оксидација
Cl
5-бромо-4-хлоро3-хидроксииндол
X-gal
OH
(5-бромо-4-хлоро-3-индолил-b-D-галактозид)
CH2OH
Бојена
реакција
H
N
b-гал
O
OH
OH
O
H
CH2
O
OH
Вештачки
индуктор
O
OH
Лактоза (галактоза-(b14)-глукоза)
CH2OH
OH
OH
Н2О
OH
OH
CH2OH
CH2OH
O
N
H
O
Cl
Индиго плаво
(5,5’-дибромо-4,4’-дихлоро-1Н,1’Н(2,2’)бииндолилдиен-3,3’-дион)
Промотор
Место
за САР
протеин
Регулатор
Промотор
и
оператор
β-Галактозидаза
Пермеаза
Трансацетилаза
Терминатор
R
LacI
P
Репресор
5’
P O
cap
LacZ
LacY
3’
T
LacA
ω-фрагмент
(C-терминус)
R
α-фрагмент
(N-терминус)
IPTG
R
IPTG
Нетрансформисана бактерија
(бела, али не расте
на ампицилину)
Бактерија трансформисана
“празним” вектором
Бактерија трансформисана
вектором са страним геном
MCS
X-gal
5’
amp
ω
3’
F’- плазмид
Бактеријски
хромозом без
Lac оперона
плазмид
ГЕН
ИНДИГО
α
ω
3’
amp
плазмид
ω
3’
Репортер гени



Репортер гени су посебан тип маркера за визуелну селекцију
чија се експресија може квантификовати (scoreable markers).
Експресија репортера се лако прати (бојене реакције,
флуоресценција)
Репортери су физички повезани са ГОИ – на истом фрагменту
ДНК, или у фузији са ГОИ
Генске фузије
Генске фузије
Само репортер
P
Репортер
3’UTR
Репортер и ГОИ
посебно
P
Репортер
3’UTR
Транскрипциони
репортер
(промотор ГОИ)
ATG
STOP
линкер
Репортер
ATG
Транслациони
репортери
ГОИ
STOP
ATG
P
ГОИ
STOP
Репортер
P
Селекција
3’UTR
ATG
P
3’UTR
ГОИ
P
STOP
Репортер
P
Одређивање ефикасности
система за трансформацију
Репортер
3’UTR
STOP
ГОИ
3’UTR
3’UTR
Праћење
експресије,
анализе
промотора и др
Најпознатији репортери





CAT – хлорамфеникол ацетилтрансфераза (застарело)
β-galaktozidaza (IPTG индуцер и ONPG супстрат)
β-glukuronidaza – разлаже разне глукурониде, користе се
они који дају бојене реакције, као X-Gluc. Користи се
само код биљака.
Луцифераза
ГФП
Green Fluorescent Protein (GFP)



GFP је мали протеин, 238 АА,
26.9 kDa са хромофором
(exc 395 i 475 nm, em 508 nm)
Изолован из медузе Aequorea
victoria, али постоји и код др.
Cnidaria
Хромофора се формира
спонтано циклизацијом и
оксидацијом (Ser66-Tyr67Glz68), заштићена
централним α-хеликсом и
спољашњим β-буренцетом.

Зашто је GFP одличан репортер?






1 полипептид
Хромофора се прави спонтано
Не затева коензиме ни кофакторе
Јако стабилан
Није токсичан
GFP се користи као:








Прегледни маркер
Репортер, фузиони репортер
Мерење експресије in vivo
Праћење експресије у времену и простору
Проучавање интраћелијског транспорта протеина
Проучавање протеин-протеин интеракција (FRET)
Обележавање једноћелијских организама, праћење ћелијски
линија
Идентификација лабораторијски организама и сојева који
се пусте у природу