GAMETOGENEZA OPLODITEV ZGODNJI EMBRIONALNI RAZVOJ Doc.dr. Borut Kovačič, univ.dipl.biol.

Epiblast Embrionalni disk

SPOLNE CELICE Dan 2 TOTIPOTENTNE CELICE Dan 5

Rumenjakova vrečka Hipoblast

Dan 14 PLURIPOTENTNE CELICE PLURIPOTENTNE CELICE ???

Primordialne klične celice

POJAV PRIMORDIALNIH KLIČNIH CELIC

Prekurzorji primordialnih kličnih celic 1 2 3 4 5 6 7 8 9 NB

Primitivni žleb Primitivna vdolbina Primitivni vozel Orofaringealna membrana Kardialna plošča Presek amnijske membrane Mezoderm Endoderm Bodoča kloaka 1+2+3 = primitivna proga

Migracija predhodnic primordialnih kličnih celic iz pluripotentnega epiblasta v ekstraembrionalni mezoderm

3. teden

Migracija primordialnih kličnih celic iz ekkstraembrionalnega mezoderma v endodermalni epitelij rumenjakovega mehurčka

4. teden

MIGRACIJA PRIMORDIALNIH KLIČNIH CELIC

Dan 21 PRIMORDIALNE KLIČNE CELICE (PRASPOLNE)

• • •

MIGRACIJA PRIMORDIALNIH KLIČNIH CELIC

Med 5.in 6. tednom potujejo iz rumenjakovega mehurčka ameboidno in s pomočjo morfogenetskih premikov proti mestu nastanka gonad (genitalnemu grebenu), ki jih kemotaksično privlači.

Med migracijo se pomnožujejo, nekatere zaidejo ali propadejo.

Nadaljnji razvoj spolnih celic vodijo somatske celice v gonadah.

5.-6. teden

8. teden

+ SRY Sertolijeve celice (AMH) Leydigove celice (testosteron)

16.-20. teden

Genitalni greben Primordialne klične celice

RAZVOJ GONAD

SRY foliklove celice semenovod ( ovidukt, maternica )

Gametogeneza poteka v treh fazah

• • •

faza delitev

(mitotične delitve)

faza rasti faza diferenciacije

- mejoza (redukcijska delitev) - funkcionalna usposobitev spolne celice

SPERMIJ in SPERMATOGENEZA

• • • • • • •

Je med najmanjšimi celicami. Vsebuje minimalno citoplazme (brez R, ER, GA).

Ima specifične strukture (akrosom in rep).

Je edina aktivno plavajoča celica.

Ima močno kondenzirano haploidno jedro z neaktivno DNA. Histoni so zamenjani z drugimi proteini. V reprod. obdobju se jih proizvede nekaj bilijonov.

•

NEZRELO MODO

(PRED PUBERTETO)

Semenski kanalček brez • • lumna, Gonociti v sredini, Sertolijeve cel. nezrele Sertolijeve celice Spermatogonij

MODO ODRASLEGA

semenski kanalček s

spermatogenezo

DELNO ZRELO

• • •

MODO

(PUBERTETA)

Vpliv gonadotropinov Nastanek lumna v kanalčkih Spermatogoniji na periferiji kanalčka Sertolijeve celice s citopl. izrastki obdajajo germinalne cel. , segajo od bazalne membrane do lumna Spermatogoniji vstopajo v spermatogenezo oz. mejozo Leydigove celice kanalčkov izven

SPERMATOGENEZA

• Začne se v puberteti. •

Spermatogoniji

se pod vplivom testosterona delijo v intervalih z mitotičnimi delitvami (As, A1, A2, A3, A4, B spermatogoniji) • Del jih vstopa v mejozo z dolgo profazo prve redukcijske delitve

Spermatociti I

(rekombinacija) .

• Po redukciji št. homolognih kromosomov –

Spermatociti II

(redko vidni) s haploidnim št. kromosomov.

• Po delitvijo kromatid (druga mejotična delitev) nastanejo

Spermatide

• Spermatogeneza do spermatide traja konstantno

70 dni.

SPERMIOGENEZA – OD SPERMATIDE DO SPERMIJA

protamini (kondenzacija kromatina )

ZORENJE SPERMIJEV V OBMODKU

•

Morfološko:

-odstranitev citoplazme, -organizacija mikrotubulov.

•

Biokemijsko:

-površinske spremembe (receptorji), -lipidna sestava membrane.

•

Biofizikalno:

-dehidracija spermija, -gibljivost.

•

Fiziološko:

-sposobnost prepoznavanja zone pelucide in akrosomske reakcije. -razgradnja spermijev.

ANATOMIJA SPERMIJA

•

Pri človeku velika morfološka heterogenost .

Glava

• • •

Membrana – Receptorji Akrosom – Hialuronidaza – Akrozin – Protein ζ (fosfolipaza C) Jedro – Kromatin neaktiven – Vakuole, – DNA-proteinski kompleks (protamini)

Vrat, rep

Centriol Mitohondrijski ovoj Biček s proteinskimi fibrilami

Sertolijeve celice

-

SERTOLIJEVE CELICE

Medsebojno povezane s tesnimi stiki.

- Ohranjajo pluripotentnost oz. diferenciacijo spermatogonijev.

- z N-kadherini povezuje spermatogonije in spermatocite.

- Pod vplivom FSH In testosterona regulirajo spermatogenezo.

- Ohranjajo v androgene v semenskih kanalčkih.

Leydigove celice

LEYDIGOVE CELICE

- Pod vplivom LH testosteron .

proizvajajo - Testosteron potuje v semenski kanalček in se veže na Sertolijeve celice.

LABORATORIJSKI PREGLED SEMENA:

Število, koncentracija, gibljivost, morfologija

SPERMIOGRAM

Diagnoza

Normozoospermija Oligozoospermija Asthenozoospermija: Teratozoospermija Oligoasthenoteratozoospermija Kriptozoospermija Azoospermija Aspermija Hipospermija Levkocitospermija

Referenčne vrednosti

> 15 x 10 9 semenčic / ml < 15 x 10 9 semenčic / ml < 50% gibljivih semenčic <5% normalnih oblik Kombinirani defekt Komaj nekaj semenčic v izlivu Ni semenčic v izlivu Ni izliva Majhen volumen izliva Levkociti v izlivu

Avtomatska analiza:

koncentracija, gibljivost, oblike gibanja

Avtomatska analiza:

morfologija

JAJČNA CELICA in OOGENEZA

• •

Nastane iz primordialnih kličnih celic.

Po namestitvi v gonadnem žepu v 6. tednu po oploditvi se primordialne celice imenujejo oogoniji .

• • •

Je Je najredkejša največja celica v telesu. celica v ženskem telesu.

Je totipotentna (proizvede vse celične tipe, fetalne membrane in horionske celice).

•

Je specializirana semenčic).

(za mejozo in pretvorbo

•

Ob koncu prvega tromesečja se začne redukcijska delitev ali mejoza - oogoniji se spremenijo v primarne oocite .

•

Ob rojstvu jih je 1-2 milijona.

I. interfaza Podvojitev kromosomov

REDUKCIJSKA DELITEV V OOGONIJIH / OOCITIH Pred rojstvom

Profaza I

Ob ovulaciji

Metafaza I Anafaza I Telofaza I Metafaza II Anafaza II Telofaza II Novitski, 2000

Ob oploditvi

MEHANIZMI ZA RAST OOCITA

1. Podaljšana profaza I ( diplotenski mirujoči stadij ), ko sta v celici 2 para kromosomov (4 kopije genov), 2. Dekondenzirana DNK vseh 4 kromatid - “ lumpbrush kromosomi ”- RNA sinteza, 3. Povezovanje s somatskimi celicami ( granulozne celice ). 4. Asimetrično postavljena delitvena ravnina v 1. redukcijski delitvi.

• Premer oocita se poveča od 35 na 120 mikrom .

Kromatinske zanke sestrskih kromatid enega homologa Sinaptonema Kromatinske zanke sestrskih kromatid drugega homologa Kohezini

JAJČNE CELICE PRED IN OB ROJSTVU

• 22 teden: oociti v diplotenu se povezujejo s somatskimi celicami, ki okoli tvorijo enoplastni ploščati epitel predgranuloznih celic -

primordialni folikli.

• Ob rojstvu 1-2 milijona primordialnih foliklov.

• Enoplastni epitel je endokrinološko neaktiven. • Njihovo jedro je še vedno v profazi I in se imenuje

germinalni vezikel oz. mehurček

.

ZGODNJA FOLIKULOGENEZA

Predpubertetni jajčnik Primordialni folikel Primarni folikel • Zorenje foliklov -

folikulogeneza

- se začne v puberteti in traja do menopauze.

• Neodvisno od gonadotropinov začne zoreti skupina primordialnih foliklov: • glede na lego v jajčniku, • glede na vaskularizacijo.

• Celice enoplastnega epitela granuloze se pomnožijo -

primarni folikli.

• Granulozne celice so v povezavi med seboj in z oocitom z

medceličnimi stiki

.

ZP2 ZP3 ZP1 Polipeptidna veriga Serin, treonin asparagin oligosaharidi

Zona pellucida:

• Proizvedejo jo GA.

• ZP je glikoproteinski ovoj.

• Razl. glikoproteini: ZP1,ZP2,ZP3 .

• ZP2 in ZP3 tvorita heterodimerne filamente; ZP1 jih povezuje.

• Na ZP3 receptorji za spermije.

CITOMORFOLOŠKE SPREMEMBE OOCITA MED OOGENEZO

RNA sinteza

• raste z rastjo folikla akumulira se v jedru; • obsežna v oogonijih med mitozo in nato konstantna v diplotenu.

Sinteza proteinov

• raste z rastjo oocita; • skladiščeni proteini + glikogen + lipidne kapljice = rumenjak ; • 50% endogenih + 50% eksogenih proteinov, ki jih prispevajo granulozne celice; • sinteza in poraba časovno ne sovpadata .

CITOMORFOLOŠKE SPREMEMBE OOCITA MED OOGENEZO

Citoplazemski organeli

• prekurzorji: mitohondriji, ER, ribosomi, GA, se pomnožijo; • postanejo bolj kompleksni (razen centriolov, ki se reducirajo ); • razporeditev organelov: primarni oociti - okoli jedra preovulatorni oociti - razpršeno po ooplazmi • GA se namestijo periferno.

• Kortikalne granule na periferiji.

Preovulatorni oocit Primarni oocit

Primarni folikel

FOLIKULOGENEZA

Predovulacijski jajčnik

cumulus oophorus antrum Graafov folikel

Sekundarni folikel

FOLIKULOGENEZA

Neodvisni od gonadotropinov Reagirajo na gonadotropine Odvisni od gonadotropinov

Oblikovanje plasti teka celic

CUMULUS OOPHORUS - CORONA RADIATA - OOCIT KOMPLEKS

JEDRNE SPREMEMBE V PREDOVULATORNEM OOCITU

PRVA REDUKCIJSKA DELITEV DRUGA REDUKCIJSKA DELITEV REDUKCIJA 1 SETA HOMOLOGNIH KROMOSOMOV V PRVO POLARNO TELO PROFAZA I REDUKCIJA 1 SETA KROMATID V DRUGO POLARNO TELO METAFAZA I ANA- / TELOFAZA I METAFAZA II

REGULACIJA JEDRNIH SPREMEMB V PREDOVULATORNEM OOCITU

GONADOTROPINI (LH) SPERMIJEVI FAKTORJI MITOZO PROMOVIRAJOČI FAKTOR (MPF)

SELEKCIJA V (ASISTIRANI) REPRODUKCIJI

Folikulogeneza: 4000 primordialnih foliklov / mesec 1000 antralnih foliklov 1 dominantni folikel 30% okvarjen oocit se ne vgnezdi zarodek 50% 20% 30% začasna vgnezditev klinična nosečnost 70% primeren oocit 20% spontan splav Porod

Oploditev

Oploditev

je proces, ko se v aktivirani jajčni celici združi jedro semenčice z ženskim pronukleusom.

Semenčica:

- kapacitacija - hiperaktivacija - akrosomska reakcija - vezava na ZP in oolemo - aktivacija jajčne celice - rekonstrukcija centrosoma - rekonstrukcija jedra

Jajčna celica:

- zrelost ovojnic, citoplazme in jedra - sprejem semenčice - aktivacija - zaključek mejoze - sinhronizacija nastanka moškega in ženskega pronukleusa

POT SPERMIJA PO JAJCEVODU

MEHANIZEM AKTIVACIJE (KAPACITACIJE) SPERMIJEV Odstranitev semenske plazme,

•

sprememba pH,

•

prisotnost proteinov, ki vežejo holesterol iz membrane Kapacitacija spermijev:

je sposobnost spermija za dostop do jajčne celice in vstop vanjo.

Destabilizacija spermijeve membrane Večja prepustnost za Ca2+ ione Povečanje konc. intracelularnega cAMP Aktivacija kinaz (protein kinaze-A) v semenčici Fosforilacija proteinov HIPERAKTIVACIJA oz. hitrejše plavanje AKROSOMSKA REAKCIJA

Akrosomska reakcija:

•Je eksocitoza akrosoma.

•Je odgovor na ekstracelularne signale iz oocita - njegove izvencelične strukture (zone pelucide) in ženskega reprod. trakta.

•Je predpogoj za oploditev.

MEHANIZEM AKROSOMSKE REAKCIJE SPERMIJEV

Ca2+

ZRK ZP3

Akrozin Zona pelucida

•

Spermij ima receptor (zona receptor kinaza ZRK ) za zono pelucido ( ZP3 ).

•

ZRK je na zunanji strani akrosoma.

•

ZP3 in ZRK omogočata vrstno specifično prepoznavanje.

•

ZRK reagira z ZP3.

•

Sprožene reakcije v glavici: - influks Ca2+ .

- perforacija membrane na akrosomu, - sprostitev proteolitskih encimov akrozina.

•

Prehod zone in stik z oolemo.

STIK SPERMIJA Z MEMBRANO OOCITA

Ca2+ Kinazna kaskada Spermij Membrana ZRK ZRK ZP3 ZP3 Zona pelucida Zeta protein Ca2+ Kalcijeve rezerve • Tangencialna vezava spermija na membrano.

• Zlitje membran spermija in oocita.

• Sprostitev spermijevega zeta proteina v oocit.

• Sprostitev Ca2+ v citosol.

• Fosforilacija proteinov.

• Kortikalna reakcija – eksocitoza kortikalnih granul.

• Sprememba ZP2 – polispermijo. blok za • Aktivacija oocita.

Ca2+ Ca2+

CIKLIČNE Ca2+ OSCILACIJE PO AKTIVACIJI OOCITA

VKLJUČEVANJE SPERMIJEVEGA JEDRA V OOCIT

• Zlije membran. • Vstopi spermijeva glavica in vratni del ( centrosom ).

• Jedrne ovojnice spermijevega jedra se razgradijo.

• Redukcija spermijevih protaminskih disulfidnih vezi in nadomestitev s histoni .

• Sledi dekondenzacija jedra faktorjev iz oocita.

s pomočjo citoplaz. • Nastane nova jedrna ovojnica . • Nastane moški pronukleus.

Kovačič in Vlaisavljević, Med. Razg., 2001, 40(1):95-105

PRITEGOVANJE PRONUKLEUSOV

• Astralni mikrotubuli iz očetovskega centriola pritegnejo pronukleusa v center.

• Prekurzorska telesca nukleolusov (NPB) - vloga nepojasnjena.

• Naj bi predstavljali centromere kromosomov z afiniteto do proteinov kinetohora - ti polimerizirajo mikrotubule, ki bi naj pritegnili pronukleuse.

Oploditev (20 ur po osemenitvi)

Normalna zigota (2PN) Partenogeneza Ginogeneza Androgeneza Triploidija Diginična Dispermična

Poliploidija ali fragmentirani pronukleusi

SAMO MOŠKI CENTROSOM JE AKTIVEN

Diploidija Monospermija Mozaik Dispermija Mozaik Dispermija-1PN Triploidija Monospermija+diginija Diploidija Monospermija+diginija 1PN

S-faza

PRVA DELITEV ZIGOTE

FAZE EMBRIONALNEGA RAZVOJA

1. BRAZDANJE

– delitve, sinteza DNA

2. BLASTULACIJA –

oblikovanje votle blastule (blastociste)

3. GASTRULACIJA

– gibanje celic (oblikovanje embrija) sinteza mRNA (diferenciacija)

1. ORGANOGENEZA

– oblikovanje tkiv in organov

2. RAST

OD OVULACIJE DO IMPLANTACIJE

ZGODNJI IN KASNEJŠI PREDIMPLANTACIJSKI RAZVOJ

•

Pred kompaktnostjo

– Maternalni genom – – Nizka stopnja biosinteze Delitev brez G1 faze – Skupek individualnih celic – Totipotentnost •

Po kompaktnosti

– Embrionalni genom – Visoka stopnja biosinteze – Diferenciacija – Pluripotentnost

NEPRAVILNOSTI ZGODNJEGA BRAZDANJA

Neenakomerna delitev blastomer.

Pojavljanje brezjedrnih citoplazemskih fragmentov. Večjedrnost blastomer.

MEHANIZEM KOMPAKTNOSTI

(Watson, 1992):

Polarizacija zunanjih celic:

• Tesnejši medcelični stiki (adherentni, tesni in presledkovni stiki) med celicami. • Premik jedra in mitohondrijev proti notranji membrani.

• Na/K ATPaza na notranji membrani ustvari ionski gradient.

MEHANIZEM NASTANKA BLASTOCELA

(Watson, 1992): • Na/K ATPase in akvaporini zagotovijo ionski gradient na notranji membrani.

• Ozmotski pritisk – voda polni blastocel.

• Tesni stiki onemogočajo iztekanje tekočine.

• Rastni faktorji regulirajo kavitacijo.

NASTANEK BLASTOCISTE

TE BC ICM

ICM - notranja celična masa BC - blastocel TE - trofektoderm ZP - zona pelucida

ZP

MEHANIZEM NENORMALNEGA RAZVOJA BLASTOCELA

: • • • Pomanjkanje tesnih stikov med blastomerami. Nepravilna polarizacija in razporeditev organelov.

Rast vakuol namesto blastocela.

.

HETEROGENA MORFOLOGIJA BLASTOCIST B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 Kovačič et al., RBM Online, 2004

Nastanek enojajčnih dvojčkov

IMPLANTACIJA BLASTOCISTE

Sinciciotrofoblast z mikrovili Pinopodi

Cytotrofoblast Sinciciotrofoblast: Placenta Hipoblast: rumenjakova vrečka Dvoplastni embrionalni disk Epiblast: Amnion

Progesteron Citotrofoblast Sinciciotrofoblast Horion Amnion Rumenjakova vrečka Horionska votlina hCG ENDODERM MEZODERM EKTODERM Progesteron