Transcript 临床免疫学实验诊断
实验诊断学 临床免疫学实验诊断 李擎天 e-mail: [email protected] 上海交大医学院附属瑞金医院检验系 Cell: 13816771290 QQ: 84251150 1 目的要求 • • • • 病毒性肝炎免疫学特征、免疫学检测方法和意义 肿瘤标志物的检测特征及其意义 自身免疫性疾病的特点和主要指标 酶联免疫吸附试验的原理，方法 • • • • • • 酶免疫组化技术概念、过程及应用。 沉淀试验、凝集试验和标记技术原理 细胞因子的检测及临床应用 T细胞和B细胞免疫缺陷病检测方法 移植排斥反应的免疫学监测 外周血单个核细胞的分离方法；细胞表面标志检测 临床免疫学实验诊断 • 实验诊断学 • 临床免疫学实验诊断 临床免疫学实验诊断 • 概述 • 感染性疾病免疫学诊断 • 肿瘤免疫学诊断 • 免疫增殖和免疫缺陷病诊断 • 超敏反应性疾病免疫学诊断 • 自身免疫性疾病诊断 • 移植免疫学 • 临床免疫学检验的自动化 4 临床免疫学与免疫检验 • 免疫检验可分为两部分： • 一部分为利用免疫检测原理与技术检测免 疫活性细胞、抗原、抗体、补体、细胞因 子、细胞粘附分子等免疫相关物质； • 另一部分是利用免疫检测原理与技术检测 体液中微量物质如激素、酶、血浆微量蛋 白、血液药物浓度、微量元素等。 免疫学技术发展史 年代 学者 贡献 1894 J. Bordet 补体与溶菌活性 1896 H. Durham, M. von Gruber 特异凝集反应 1896 G. Widal, A. Sicad 肥达试验 1897 R. Kraus 沉淀试验 1900 J. Bordet, O. Gengou 补体结合反应 1900 K. Landsteiner 人类ABO血型及其抗体 1906 A. Wassermann 梅毒补体结合反应 1935 M. Heidelberger, F. Kendall 纯化抗体,定量沉淀反应 1941 A. Coons 免疫荧光标记 1946 J. Oudin 凝胶内沉淀反应 1948 O. Ouchterlony, S. Elek 双扩散沉淀反应 1953 P. Grabar, C. Williams 免疫电泳分析,Ig多样性 1960 R. Yallow, S. Berson 放射免疫标记 1966 S. Avrames, J. Uriel, et al 酶标免疫技术 1975 G. Kohler, C. Milstein 杂交瘤技术与单克隆抗体 发展进程的主要阶段 • 自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应） • 加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术） • 标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性 • 半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反 应过程 • 标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合 免疫检验涉及的主要技术 • 放射免疫技术 化学发光免疫技术 • 荧光免疫技术 流式细胞免疫技术 • 酶联免疫技术 免疫印迹技术 • 透/散射免疫技术 单克隆抗体技术 概述：凝集反应 9 单向琼脂扩散试验 10 免疫比浊法原理 抗体 抗原 免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关 测吸光度 计算抗原 或抗体的 含量 11 概述：标记免疫技术 概念：用荧光素、酶、同位素等标记抗体 或抗原用以测定相应抗原或抗体的技术。 免疫荧光技术、酶免疫技术、放射免疫检 测技术等。 特点：敏感、特异、快速，能定性、定量、 定位。 12 免疫荧光技术 13 酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法) 14 斑点金免疫渗滤试验 A B 加尿样 除去滤器 阴性（未怀孕） C 加胶体金标记抗体 D 加洗涤液 15 化学发光/电化学发光技术 免疫印迹法图解 电转印至NC膜上 置待测血清中，漂洗； 加酶标抗抗体，漂洗； SDS裂解 病毒 加底物 聚丙酰胺凝胶电泳 - 显色 + 95 68 45 12KD 120 41 24KD 17 临床应用 一 感染性疾病免疫学诊断 • （一）病毒性肝炎 • （二）细菌感染 • （三）病毒感染 • （四）真菌感染 • （五）寄生虫感染 • （六）其他 19 肝炎 • 甲型肝炎乙型肝炎 • 丙型肝炎丁型肝炎 • 戊型肝炎 20 甲型肝炎免疫学检测 • 抗体检测 –IgM型：常用IgM抗体捕 捉ELISA检测法 –IgG型：双份血清，用 于流行病学调查、既往 感染或疫苗效果评价 • 抗原检测 –ELISA夹心法 –难以常规开展 21 实验室检查 蛋白质代谢功能检查 胆红素代谢检查 常用的血清酶及同工酶检查 肝纤维化常用标志物检测 22 乙型肝炎病毒抗原抗体系统检测结果分析 HBsAg HBeAg 抗-HBs 抗-HBe 抗-HBc 结果分析 + - - - - HBV感染或无症状携带者 + + - - - 急性或慢性乙型肝炎，或无症状 携带者 + + - - + 急性或慢性乙型肝炎（传染性强， “大三阳”） + - - + + - - + + + 既往感染恢复期 - - + + - 既往感染恢复期 - - - - + 既往感染或“窗口期” - - + - - 既往感染或接种过疫苗 急性感染趋向恢复（“小三阳”） 23 丙型肝炎免疫学检测 • 免疫学：筛选试验 ELISA、放射免疫法抗 HCV IgG或IgM。 • 抗HCV IgM早期诊断。 • 确证 免疫印迹法 24 丁型肝炎免疫学检测 1）HDV抗原 2）抗HDV IgM 3）抗HDV 25 戊型肝炎免疫学检测 抗体检测 IgM型：诊断指标， ELISA法 IgG型：双份血清，流 行病学调查、既往 感染或疫苗接种效 果评价 病毒抗原 26 （二）细菌感染免疫学诊断 人感染病原体产生特异性抗体可持续一段时 间，→现症诊断，疾病追溯。 1.血清抗链球菌溶血素“O”试验：A链 • 近期感染，活动性风湿热、风湿性关节炎 、心肌炎、急性肾小球肾炎、急性上呼吸 道感染、皮肤和软组织的感染等 27 （二）细菌感染免疫学诊断 2.伤寒副伤寒沙门菌IgM抗体：ELISA法阴性 或滴度＜1:20；IgM抗体早期诊断价值。 3 . 伤寒副伤寒沙门菌可溶性抗原测定：乳胶 凝集法为阴性。确诊伤寒沙门菌感染。 4.结核分枝杆菌抗体测定：胶体金或ELISA法 检测抗体阴性。结核分枝杆菌感染。 28 （三）病毒感染免疫学诊断 • TORCH：弓形虫，风疹病毒，巨细胞病毒 ，单纯疱疹病毒ⅠⅡ型抗体检测 • 早孕时胎儿先天性风疹感染，新生儿致残 致畸率可达80％，损害五官神经系统 • IgM抗体出现均应做咨询。IgG抗体应注意 滴度变化，滴度低且无变化为既往感染， 双份血清滴度升高4倍以上。 29 （三）病毒感染免疫学诊断 • 单纯疱疹病毒（Ⅰ型和Ⅱ型） • 致畸性、影响新生儿神经系统发育，IgM和 IgG抗体的检测， IgM型为近期感染， IgG 型多为既往感染。 • 巨细胞病毒﹙CMV﹚造成神经系统及智力 的障碍。 • EIA法测IgM了解近期感染， IgG流行病学 调查。 30 （三）病毒感染免疫学诊断 3 嗜异性凝集 — 传染性单核细胞增多症 E B 病 毒感染：感染后 2 周抗体效价达高峰，常＞ 1：56；3个月后消失；效价上升4倍以上； 更有诊断价值。 4严重急性呼吸综合征病毒抗体 SARS冠状病毒。抗体阳性表明感染过，阴 性到阳性血清转化，或急性期到恢复期抗 体效价增高4倍以上，表明有近期感染。 31 （三）病毒感染免疫学诊断 （四）真菌感染免疫学诊断 • 意义有限 33 （五）寄生虫感染免疫学诊断 弓形虫抗体 囊虫抗体测定：人和猪共患的寄生虫病。 [参考值]①ELISA法：血清低于1：64为阴 性；脑脊液低于 1 ： 8 为阴性②间接血凝法 ：血清低于1：128为阴性；脑脊液低于1： 8为阴性。 [ 临床意义 ] I g G 阳性见于囊虫病，可用作流 行病学调查。 34 （六）其他感染免疫学诊断 性传播疾病：衣原体、支原体、梅毒螺旋体 、淋球菌、HIV引起。 1 衣原体抗体测定 沙眼衣原体 ( C T ) 是引起性传播疾病常见的 病原体之一。 ① I g M 阳性提示近期有 C T 感染，有利于早 期诊断；②IgG在发病后6－8周出现，持续 时间较长；提示曾有过CT感染 35 （六）其他感染免疫学诊断 支原体血清学检测：肺炎支原体、解脲人 原体、人型支原体和生殖道支原体。 单份血清效价＞1：64－128者或双份血清 有4倍以上增长者，有诊断意义。 3 梅毒螺旋体抗体测定 梅毒螺旋体反应素试验敏感性高；定性试 验阳性的情况下，必须进行确诊试验，若 阳性可确诊梅毒。 4 淋球菌血清学测定 2 36 二 肿瘤免疫学诊断 • 血清肿瘤标志物检测 • 细胞表面肿瘤标志物检测 • 患者免疫功能状态评估 • 临床意义：①早期诊断和发现肿瘤；②提 示肿瘤发生的部位和组织来源；③判别肿 瘤恶性程度；④监测临床治疗效果；⑤监 测肿瘤复发。 37 38 肿瘤标志物 肿瘤组织产生的、可反映肿瘤自身存在的化 学物质。大分子蛋白质(包括肽类、激素和 酶)，小分子脂类和氨基酸衍生物。 39 肿瘤标志物 • 标志物的多样性 同一肿瘤可有多种标志物。联合检测 • 标志物定位相对特异性 同一标志物在多种肿瘤中存在。标志物在某 些良性疾病中，一过性升高。（动态诊断） • 标志物的多变性 随病情发展而升高 随治疗见效而下降 随复 发转移再升高（动态随访） 40 肿瘤标志物 细胞肿瘤标志物： 位于细胞中的物质或抗原，如激素受体 、白血病表型、分子基因等。 体液肿瘤标志物： 病理情况下，浓度增加时可在血液、尿 液或其他体液中测得的物质，如AFP、 CA19-9、CEA、CA15-3等。 41 肿瘤标志物 酶类 激素类 癌胚抗原类 糖类抗原 42 肿瘤标志物 ROC曲线 假阴性率是指将患者错 误地判定为无病的比例 （即1-灵敏度）。 假阳性率＝1－特异度 。 43 血清肿瘤标志物检测 甲胎蛋白属肿瘤胚胎蛋白。胚胎期 AFP由卵 黄囊和肝脏产生，成人肝脏只产生微量 AFP。 肝细胞癌、卵黄囊瘤、胚胎性癌的肿瘤标志 。妊娠/ 良性肝病 44 血清肿瘤标志物检测 • CEA：胃肠道恶性肿瘤、乳腺癌、肺癌等 • 广谱 • 诊断、监测、预后、疗效评价 • 大分子糖蛋白，属肿瘤胚胎蛋白。胚胎期 由肝、胃肠及胰合成。肠癌、胃癌、肺癌 、胰腺癌等都可见血清CEA水平升高。 • 作为消化道癌瘤的标志。 45 血清肿瘤标志物检测 • PSA：前列腺癌/前列腺增生 • 监测疗效、判断预后 50岁以上男性每年普查1次 46 血清肿瘤标志物检测 • PAP前列腺酸性磷酸酶： • 前列腺癌诊断、疗效、预后监测 酸性磷酸酶可来自正常前列腺细胞，亦可来 自癌细胞。 血清前列腺酸性磷酸酶 ( P S A P ) 的监测在早期 前列腺癌的诊断、前列腺癌病情的监测、 鉴别诊断方面都有帮助。 47 神经原特异性烯醇化酶（NSE） • 同功酶类肿瘤标志物，小细胞肺癌、神经 母细胞瘤和神经内分泌肿瘤及脑损伤时升 高。待测标本绝对禁止溶血。 • NSE高预示生存期短，下降是疗效良好标志。 48 激素类肿瘤标志物 • 肺癌：NSE、CYFRA21-1、CEA • 乳腺癌：CA153、CEA • 肝癌：AFP、AFU、CEA、AKP同工酶 • 胰腺癌：CA242、CA199、CA50 • 卵巢癌：CA125、CEA、CA199、HCG • 联合应用可大大提高检出的灵敏度 49 血清肿瘤标志物检测 • 糖类抗原标志物是由肿瘤细胞分泌的或者 是肿瘤细胞表面的抗原。针对这些抗原的 单克隆抗体已成为临床上较为有用的肿瘤 标志物，比天然分泌的标志物（如酶和激 素）更敏感。 50 血清肿瘤标志物检测 • 糖链抗原CA19-9：消化道恶性肿瘤 • 胰腺癌、肝胆系统癌、胃癌和大肠癌，特 别是胰腺癌。 • 糖链抗原CA125：卵巢癌 • 是卵巢癌和子宫内膜癌的肿瘤标志物 51 血清肿瘤标志物检测 • 糖链抗原CA50：胰腺癌、结肠直肠癌、胃 癌。非特异性广谱肿瘤标志物。 • 糖链抗原CA15-3：乳腺癌诊断、术后监测 乳腺癌患者30-50%增高，转移者增高达80%； 52 血清肿瘤标志物检测 • 方法：酶免、荧光、放射 • 意义：早期诊断、鉴别良性恶性、发生部 位和程度、监测疗效、预防复发 53 血清肿瘤标志物检测 • 方法：荧光 放射 54 细胞表面肿瘤标志物检测 • 免疫组化、流式细胞术 55 患者免疫状态评估 • T细胞及亚群 • NK细胞吞噬细胞功能 • 抗体、补体、细胞因子水平 56 三 免疫增殖和免疫缺陷病诊断 • 免疫器官、免疫组织、免疫细胞异常增殖 引起的机体病理损伤。 • 淋巴系统异常增殖所引起的疾病。 • 先天遗传因素或后天因素造成的免疫系统 发育、分化、代谢或相互调节的不同环节 发生障碍，导致免疫功能低下或缺失，临 床表现以感染为主的一组综合征。 57 单克隆免疫球蛋白病诊断 • 对免疫球蛋白异常增殖病的检测，其目的 是早期发现疾病、监控病情和判断预后。 58 单克隆免疫球蛋白病诊断 • • • • • • • 血清蛋白区带电泳 免疫电泳 免疫固定电泳 血清免疫球蛋白定量 免疫球蛋白轻链型筛选 本周蛋白检测 冷球蛋白检测 59 血清蛋白区带电泳 • 测定M蛋白的一种定性实验，常采用醋酸纤 维素膜和琼脂糖电泳两种方法。 M蛋白在电泳时出现于～区带中，不同类型 的M蛋白的电泳后所处位置略有不同 60 血清免疫球蛋白定量 病人 IgG IgA IgM KAP LAM K/L（g/l) 姓名 8～15 0.85～3.0 0.5～2.5 1.72～3.83 0.81～1.92 1.47～2.95 A 46.2↑ 0.23↓ 0.17↓ 0.26↓ 16.80↑ 0.02↓ B 7.36↓ 0.31↓ 26.90↑ 5.11↑ 1.02 5.01↑ C 1.78↓ 49.50↑ 0.17↓ 18.20↑ 0.18↓ D 2.77↓ 0.23↓ 0.22↓ 0.72↓ 0.95 0.76↓ E 4.91↓ 0.34↓ 0.29↓ 1.02↓ 2.00↑ 0.51↓ F 38.70↑ 1.93 2.00 7.34↑ 4.08↑ 1.80 101.11↑ 61 肾损伤型 • 特点：选择性蛋白丢失 总蛋白和白蛋白均严重降低 α2-球蛋白显著升高 β-球蛋白降低/正常/升高 γ-球蛋白正常/降低 常见于肾病综合征 62 肝损伤型 • 特点： 白蛋白、α1、α2、 β-球蛋白合成减少，γ-球 蛋白合成增加。 总蛋白降低/正常 白蛋白严重降低 α1-球蛋白、α2-球蛋白、 β-球蛋白降低 γ-球蛋白升高 常见于重症肝炎、肝硬化、 肝癌 63 急性感染与应激状态 • 特点：α1糖蛋白等急性时相反应蛋白增加 。 Alb减少或正常， α1、α2-球蛋白增高， γ-球蛋白增高不明显，当炎症转为慢性时 ，可明显增加。 64 慢性炎症型 • 特点：γ-球蛋白显著升高 总蛋白降低/正常/升高 白蛋白降低 α1-球蛋白、α2-球蛋白升高 β-球蛋白升高/降低 γ-球蛋白显著升高 • 常见慢性感染、风湿病及其它自身免疫病 65 低蛋白血症型 • 特点： 总蛋白和白蛋白明显减低 α1-球蛋白正常/升高 α2-球蛋白正常/降低 β-球蛋白降低 γ-球蛋白正常/降低 常见于营养不良、吸收不良、非选择性蛋 白丢失 66 单克隆高γ-球蛋白血症型 • 特点：α2、β或γ区出现单克隆条带，正 常免疫球蛋白带减弱或消失 。 见于良、恶性M蛋白病、多发性骨髓瘤、重 链病、轻链病、半分子病、淋巴瘤、某些 白血病。 67 免疫缺陷病实验诊断 • B细胞缺陷病检测 血清Ig测定 同种血型凝集素的测定：ABO血型抗体 特异性抗体产生能力测定 噬菌体试验 B细胞表面膜Ig检测-免疫组化 CD抗原检测 68 免疫缺陷病实验诊断 • T细胞缺陷病的检测 皮肤试验：迟发型超敏反应DTH能力 T细胞及其亚群检测：CD标记 T细胞功能检测：PHA刺激淋巴细胞增殖转化 结核菌素试验 69 MTT比色 • MTT是一种噻唑盐，胞内线粒体琥珀酸脱 氢酶底物反应后呈蓝黑色甲潜颗粒+盐酸异 丙醇溶（570nm）。 70 免疫缺陷病实验诊断 • 吞噬细胞缺陷病检测 白细胞计数 趋化功能检测 吞噬和杀伤试验 NBT还原试验 黏附分子检测 71 免疫缺陷病实验诊断 • 补体系统缺陷病检测：C1INH • 基因诊断 72 免疫缺陷病实验诊断 • • • • HIV检测 病毒标志检测：分离病毒组分 免疫标志检测 非特异性检测：T细胞亚群等 73 免疫缺陷病实验诊断 74 免疫缺陷病实验诊断 ①初筛（ELISA、IFA、RIA） ②确证：免疫印迹试验,至少同时测两种抗 体(P24、gp120)阳性,方可判断HIV感染 75 样 本 选用初筛试剂 初筛检测 阳性反应 阴性反应 重复检测 阴性报告 一阴一阳 均阴性反应 原有试剂＋另一 种原理初筛试剂 均阳性反应 送确认 阴性报告 HIV抗体初筛检测流程图 76 HIV抗体确认实验结果 a b c d gp160 gp120 p66 p55 p51 gp41 p39 p31 P24 p17 血清对照 HIV-2特异带 a 强阳性对照（HIV-1和HIV-2） b 弱阳性对照（HIV-1） c 阴性对照 d 典型的HIV-2血清阳性反应 77 初筛检测阳性标本 复 阳性反应 核 两种初筛试剂 一阴一阳 阴性反应 阴性报告 免疫印迹法WB-1/2混合型 HIV-1 阳性反应 HIV-1 阳性报告 可疑反应 阴性反应 出现gp36 阴性报告 免疫印迹法WB-2 HIV-2 阳性反应 可疑反应 报告HIV-2血清学 阳性反应,必要时测核酸 阴性反应 阴性报告 每三个月随访一次，共两次，仍属可疑，判为阴性 HIV抗体确认实验流程图 78 CD4+T细胞绝对数量 79 体液免疫检测 • • • • 1.单向免疫扩散 (SRID). 2.透射比浊、散射比浊. 3.ELISA，RIA (IgD,IgE). 4.免疫电泳. 80 细胞免疫检测 • 1.皮肤试验 • 2.T细胞及其亚群的检测 • 3.E玫瑰花结试验 • 4.T细胞体外免疫功能检测 （1）淋巴细胞增殖反应试验 （2）T细胞分泌产物功能的检测 81 四 超敏反应性疾病免疫学诊断 82 I型超敏反应检验：血清IgE检测 • 血清总IgE测定：标记技术 ELISA 放射免疫吸附试验 化学发光法 • IgE升高：过敏性哮喘、过 敏性鼻炎、特应性皮炎、 IgE骨髓瘤等 • 超敏反应≠IgE升高 83 I型超敏反应检验：血清IgE检测 • 血清特异性 IgE检测：针 对特异性变 应原的IgE 84 II型超敏反应的检验：Coombs试验 自身免疫性溶血性贫 血、冷凝集素综合征 、药物免疫性溶血性 贫血、新生儿溶血病 、系统性红斑狼疮、 类风湿、恶性肿瘤。 正常红细胞(rh阳性的 85 o型红细胞) II型超敏反应的检验：免疫组化技术 • 1、特异性强 抗原与抗体之间的结合具有 高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲 也是组织细胞中抗原的特定显示。 • 2、敏感性高 ABC法或SP法的出现，使抗体 稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组 织细胞中与抗原结合。 • 3、定位准确、形态与功能相结合 通过抗 原抗体反应及呈色反应，可准确定位，进 行形态与功能相结合的研究。 86 Ⅲ型超敏反应的检验：CIC检测 • 循环免疫复合物检 测 • PEG比浊法：选择性 沉淀免疫复合物。 简便敏感、特异性 差、影响因素多。 87 Ⅲ型超敏反应的检验：CIC检测 • • • • • 循环免疫复合物检测 C1q固相法：C1q—重链CH2补体结合点 抗C3-CIC-ELISA： 胶固素结合试验： 单克隆RF固相抑制试验： 88 Ⅲ型超敏反应的检验 • 组织固定免疫复合物检测 • 免疫组化技术 • 抗人IgG、抗人C3 89 IV型超敏反应的检验 • 结核菌素实验（皮内试验） • 结核菌素皮试 OT、PPD “+” 感染过结核 “-” 可基本排除结核 假阴性：播散性结核、麻疹、 淋巴瘤、细胞免疫功能缺陷 假阳性：非典型分枝杆菌 90 五 自身免疫性疾病诊断 • 机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而 导致的疾病状态 • 自身免疫应答过分强烈，导致自身组织器 官损伤或功能障碍 • 自身抗体/自身反应性T细胞 91 自身免疫病的基本特征 • • • • • • 高效价自身抗体和/或自身反应性T细胞 组织器官损伤、功能障碍 可复制出病理模型 病情转归与自身免疫应答强度相关 反复发作慢性迁延，糖皮质激素可缓解 病因不清，女性易患，遗传倾向 92 自身免疫性疾病诊断 • • • • • • 自身抗体检测-抗核抗体 自身抗体检测-类风湿因子 淋巴细胞检测 狼疮细胞试验 免疫复合物、补体检测 细胞因子检测 93 自身抗体检测-抗核抗体 • 自身抗体检测方法：间接免疫荧光法、 ELISA、RIA、免疫印迹法 • 抗各种核成分的抗体 • IgG为主 • SLE等多种自身免疫病 94 自身抗体检测-抗核抗体 • • • • 抗DNA抗体：天然/双链、变性/单链 间接免疫荧光法 ELISA RIA 95 自身抗体检测-抗核抗体 • 抗ENA抗体：盐水可提取性核抗原的抗体 。是抗小分子细胞核核糖核蛋白（snRNPs ）和小分子细胞浆核糖核蛋白（scRNPs） 的自身抗体，不含组蛋白。 • 抗原进行SDS-PAGE 96 自身抗体检测-抗核抗体 • 抗ENA抗体： • 抗u1RNP：混合结缔组织病MCTD 抗Sm、Rib：SLE 抗SS-A、SS-B：干燥综合征SS 抗Scl-70：硬皮病PSS 抗Jo-1：多发性肌炎/皮肌炎 PM/DM 97 自身抗体检测-类风湿因子 • 抗变性IgG Fc自身抗体。并非RA特异抗体 • ELISA • 约90%（RA）患者RF阳性。IgA-RF与骨质破 坏有关，早期IgA-RF升高常提示病情严重 ，预后不良；IgE-RF升高时已属晚期。 • 冷球蛋白血症、进行性全身性硬化症、干 燥综合征、SLE等患者都有较高阳性率；血 管炎、肝病、慢性感染也可出现RF。 98 淋巴细胞亚群 • 单克隆抗体将外周淋巴器官或外周血中T细 胞分为CD4+和CD8+两个主要亚群。每个亚群 按表面标志和功能分为不同亚群。 • Th1和Th2亚群 应用Th细胞克隆培养技术和 细胞因子产生的不同，CD4阳性细胞群分为 Th1和Th2。Th1细胞合成IL-2/3、IFN-γ、 TNF-α和GM-CSF，Th2合成TNF-α、IL3/4/5/6/10/13、GM-CSF。 99 混合淋巴细胞反应 • 自身混合淋巴细胞反应：外周血B细胞和单 核细胞等非T细胞在体外培养时能诱导某些 自身T细胞发生增殖反应，称为自身混合淋 巴细胞反应。这一部分T细胞称为自身反应 性T细胞。 100 免疫复合物、补体检测 • CIC增加，补体消耗，动态变化 • 总补体CH50：50%溶血试验即求得能使50% 致敏羊红细胞发生溶血的最小量血清，然 后计算出每毫升血清中补体含量。 • 以补体量作为横坐标，溶血百分数作为纵 坐标，50%溶血周围近似直线。 • 单一补体浓度 • 疾病进展、疗效 101 细胞因子检测 • Th1、Th2平衡失调 • 细胞因子是一类在细胞间传递信息、具有 免疫调节和效应功能的蛋白质或多肽。 • 淋巴因子、单核因子、各种生长因子等。 • 作用：参与免疫应答与免疫调节;刺激造血 功能。 102 ANA的检测方法 间接免疫荧光法 103 检测方案 104 检测方法 • 同ANA ELISA 105 检测方法-免疫印迹法 106 检测方法-RIA法 γ计数器所测量放射性同位素的强度， 用得较多的标记化合物是14C、3H、125I、 131I。 107 类风湿因子测定方法 • 胶乳凝集试验 • 速率散射浊度法 • ELISA法 108 六 移植免疫学 109 预防排斥反应的免疫学措施 • • • • • 移植物预处理 组织配型 交叉配合试验 免疫抑制 免疫耐受 110 移植物预处理 • 灌洗：清除免疫细胞 • 加入单克隆抗体、补体 • 放射线照射 111 组织配型 • • • • • • 组织相容性程度越高，存活几率越大 ABO血型必须相同或相容 HLA相容：HLA-A、HLA-B、HLA-DR 造血干洗胞移植：必须配合 心肾肠移植：HLA-DR 肝肺移植：主要ABO 112 HLA 113 HLA配型 114 HLA配型 Immunology, 2nd edition. 115 HLA分型结果 116 HLA配型 Immunology, 2nd edition. 117 交叉配合试验 • 淋巴细胞毒交叉配合试验，lymphocyte cytotoxicity crossmatching：检测受者体内 抗供者淋巴细胞的细胞毒性抗体。 118 预防免疫排斥措施 • 1、寻求与受者MHC相配的供者组织或器官 • 2、移植后的免疫监护 • 3、正确合理选用免疫抑制疗法 • 4、诱导对移植抗原的特异性耐受 119 预防免疫排斥措施 120 免疫抑制 • 全身淋巴组织照射选择性淋巴组织照射： 免疫抑制剂：化学性 • 硫唑嘌呤+皮质类固醇 • 环孢素A +皮质类固醇 121 免疫抑制 • 生物性免疫抑制剂—融合蛋白： • 生物性免疫抑制剂—反义寡核苷酸 Immunology, 2nd edition. 122 免疫抑制 • 天然药物 • 雷公藤、冬虫夏草等 123 预防免疫排斥措施 • 诱导对移植抗原的特异性耐受 对供者抗原的特异性无应答 • 不用药、不感染、不排斥 1 多次输血 2 转基因（MHC） 3 微嵌合 124 移植排斥反应的免疫学监测 • 并无理想的免疫学实验能准确监测排斥反 应及移植物功能丧失 • 一 供者特异性免疫反应监测 • 二 非供者特异性免疫学指标监测 125 七 临床免疫学检验的自动化 • 早期如免疫扩散、免疫电泳、血凝试验、 补体结合等 • 70年代初，开始有自动检测系统，激光光 源，固定波长，灵敏度低，2—3小时 • 70年代未，速率比浊，几十秒 • 自动化免疫分析系统飞速发展免疫化学可 以纳入临床化学检验范畴 • 基础是抗原抗体的结合，高特异性；利用 标记技术而将信号放大，高灵敏度 126 七 临床免疫学检验的自动化 • 免疫比浊分析技术 • • • • • 化学发光、电发光分析技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶免疫分析技术 流式细胞术 127 免疫比浊 • 利用抗原抗体结合后溶液的浊度变化而检 测的一种方法 • 准确快速，已成为免疫诊断技术中重要的 检测手段 • 比浊法与比色法 128 免疫透射比浊 • 基本原理：检测信号是通过溶液的光，测 量角度与正前方夹角为0℃，保持抗体过量 ，形成可溶性AG-AB复合物，使介质浊度 发生改变。 • 实验要求： 选择亲和力高的抗体，抗原抗体复合物要 大、数量要多，反应时间充分。 130 胶乳浊度测定法 132 自动免疫浊度分析仪 • 校准程序，使仪器处于正常的工作状态 • 定标程序，保证检测结果的准确性 • 自动控制，保证实施实验条件中的抗原抗体反 应体系要求 • 自动系统，障碍的检测和预警。 133 自动化免疫仪器种类 • 免疫比浊分析技术 • 化学发光、电发光分析技术 • • • • 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶免疫分析技术 流式细胞术 134 化学发光自动免疫分析 • 化学发光是指在化学反应过程中产生光的 发射现象 • 基本原理：标记在抗原或抗体上的发光物 质在碱性介质中氧化时产生激发态中间体， 中间体回基态产生辐射，多余能量发射光 子，产生发光现象，对光信号进行接收转 化，可得检测物浓度 135 化学发光自动免疫分析类型 • 电化学发光免疫分析（ECLIA） 电极表面由电化学引发的特异性化学发光 反应，包括电化学和化学发光，应用“亲和 素-生物素”放大系统，灵敏度大大提高 • 双抗体夹心法 136 临床应用 • • • • • 激素 肿瘤标记物 内分泌功能 传染性疾病 其它 –如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白 、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目 。 138 自动化免疫仪器种类（应用技术） • 免疫比浊分析技术 • 化学发光、电发光分析技术 • 荧光免疫分析技术 • 放射免疫分析技术 • 酶免疫分析技术 • 流式细胞术 139 荧光免疫自动化 • 利用荧光物质标记抗原抗体的检测方法 • 免疫反应、荧光及计算机技术联合应用 • 时间分辨荧光免疫和荧光偏振免疫 经单一平面的蓝偏振 光照射后，吸收光能 跃入激发态，随后回 复至基态，并发出单 一平面的偏振荧光。 140 荧光免疫自动化 • 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）：AGAB结合，荧光物质（镧氏元素铕螯合物） 发长寿命荧光，利用延迟时间来消除非特 异性的荧光干扰。 141 荧光免疫自动化 • 荧光偏振免疫测定：以小分子物质与大分 子物质的旋转差异而使它们对偏振光的吸 收不同为依据检测小分子药物 142 自动化免疫仪器种类（应用技术） • • • • • 免疫比浊分析技术 化学发光、电发光分析技术 荧光免疫分析技术 放射免疫分析技术 酶免疫分析技术 • 流式细胞术 143 流式细胞仪 • 流式细胞仪（FCM）是以激光为光源，检 测生物学颗粒理化性质的仪器 • 生物学颗粒包括免疫复合物、DNA、RNA 、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、 细胞、染色体、真核细胞等 • 理化性质则为细胞大小、形状、胞浆颗粒 、DNA含量、酶活性等 144 流式细胞仪 • FCM综合了激光技术、电子技术、流体力 学、细胞化学及计算机技术，广泛应用于 细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、 病理学、遗传学、临床检验学等 145 146 思考题 • • • • • 分析自身免疫性疾病的特征 如何确定候选肿瘤标志物的检测参考值 设计实验证实某血清蛋白质与移植排斥有关 病毒性肝炎的免疫学检测和分子生物学检测特点 HIV感染的监测 临床免疫学实验诊断 • 概述 • 感染性疾病免疫学诊断 • 肿瘤免疫学诊断 • 免疫增殖和免疫缺陷病诊断 • 超敏反应性疾病免疫学诊断 • 自身免疫性疾病诊断 • 移植免疫学 • 临床免疫学检验的自动化 148