Transcript 流式分选仪的原理及应用
BD Influx流式分选 仪的原理及应用介绍 BD生物科学 孔祥涛 [email protected] 400-819-9900, 13564764795 BD Introduction BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于 1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。 Maxwell W. Becton Fairlegh S. Dickinson 经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医 疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可 信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。 BD Introduction BD生物科学作为BD的一个业务组成，一直致力于为生命 科学研究者和临床医生提供创新的临床和科研工具。其主要 产品包括流式细胞仪；细胞图象分析系统；单克隆抗体和试 剂盒；药物研发产品及临床诊断试剂等。 1973年世界第一台商品化的流式细胞仪FACS I BD Introduction T Cells Research BD HLA-B27 Kit Stem Cells BD Introduction BD Introduction www.bdbiosciences.com/cn/ 流式分选仪的原理及应用 • 流式分选的原理 • 流式分选的影响因素 • 流式分选的应用 • 分选流程及注意事项 Flow Cytometry Principles 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种快速、准确、客观的同时 检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。 检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这是流 式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量 可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮 或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。 Flow Cytometry Principles 分析型流式细胞仪 VS 分选型流式细胞仪 Calibur Influx 电子偏转的方式 流式分选仪的原理及应用 • 流式分选的原理 • 流式分选的影响因素 • 流式分选的应用 • 分选流程及注意事项 完美的分选 速度 纯度 得率 高速分选的影响因素 •鞘液压力（Pressure ) PSI •振荡频率 (Drop Frequency) Hz •喷嘴大小 (Nozzle) μm •上样速度(Sample Flow Rate ) events/sec Tips: 如何提升分选速度 • 提高样本浓度 • 适当牺牲分选的纯度和得率 • 减小喷嘴的孔径 • 提升鞘液的压力 • 提高液滴的振荡频率 分选最重要的问题 • Good Purity – 分选后所得到的细胞是否是想要的？ • Good Recovery – 分选后得到的细胞数量是否够用? • Good Viability – 分选后有多少细胞是活的？ Tips: 如何提升分选的纯度 • 设置合适的分选模式 • 选择合适的喷嘴孔径 • 确保稳定的液流断点 • 设置正确的drop delay • 进行4路分选时，将纯度要求高的细胞分选设置在 最外的2路 • 减少样本的粘连 • 正确的设门 • 确保上样管路清洁后回测 BD Influx: 液流系统 独特的声学耦合设计使得液滴形成时，信噪比最高 • 70 kHz 振荡频率，对应 35 PSI 鞘液压力 • 最大限度降低液滴形成时带来的信号噪音 对细胞剪切压力最小化 • 高压力时细胞活性保持最好 • 分选大细胞，脆弱细胞时尤为重要 • 细胞在液流里的排列最好 • 对断点稳定性的影响更小 侧液流的稳定性也会更好 • 对单细胞分选尤为重要 BD Influx: 分选系统 速度 • 喷嘴的独特设计使得低压高速的分选得以实现 纯度 • >98% 活性 • 由于喷嘴的独特设计，实现了低压高频分选的可能，最 大限度保证细胞的活性和功能不受损 Tips: 如何提升活力 • 无菌环境的控制 • 降低鞘液压力 • 增大喷嘴孔径，脆弱细胞必须要用大孔径喷嘴 • 包被样本收集管 • 温度控制 • 提升速度 流式分选仪的原理及应用 • 流式分选的原理 • 流式分选的影响因素 • 流式分选的应用 • 分选流程及注意事项 Flow Cytometry Applications 分选流式应用领域 • 免疫学 • 肿瘤学 • 干细胞领域 • 植物学应用 • 染色体分选 • More… 1.免疫学：需要多色分析 低含量信号检测：快速分析 Influx分析速度：200000个/秒， 低含量信号分选：快速分选 Influx分选速度：100000个/秒 外周血淋巴细胞中CD4+和CD25+FoxP3+ Tregs检测 www.bdbiosciences.com/spectra 2.肿瘤学 CA CANCER J CLIN 2010;60:277–300 细胞周期、DNA倍体、凋亡检测 细胞周期 细胞凋亡 蛋白磷酸化检测 Control TPA (100 nM) treated 信号转导通路蛋白的磷酸化分析 线粒体膜电位检测 利用JC-1探针分别对正常（左）和诱导凋亡（右）的细胞 进行线粒体膜电位检测 肿瘤研究的挑战 如何在早期检测出含量极其稀少的肿瘤细胞成为诊断的 关键。如何在治疗后缓解的病人体内监测肿瘤细胞的含 量是预防复发的根源。多数肿瘤在血清学上并无明确指 标。人体免疫系统抵抗和清除血液病肿瘤细胞的能力大 致在血液肿瘤细胞的含量在万分之一以下。 外周血循环肿瘤细胞（CTC） 肿瘤复发的关键是肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞具有 永生的能力，并且耐药性远远强于普通的肿瘤细胞。鉴 定、分选纯化出肿瘤干细胞作为靶细胞进行抗肿瘤药物 的开发有重要意义。 肿瘤干细胞 BD Influx解决方案 Influx具有目前行业内最低极限的稀有含量细胞的检测和 分选能力，下限低于十万分之一。分选纯化后的外周血/ 脑脊液/尿液等体液内的肿瘤细胞可以进行病理、QPCR等 分子生物学方法的诊断，可极大提高灵敏度和检出率。 Influx不仅能将极地含量的肿瘤细胞或肿瘤干细胞分选纯 化出来，还能对细胞的46条染色体进行染色体移位等异常 的检测和单条染色体的分选，将极大提高肿瘤基因组的研 究效率 肺癌细胞的基因序列，Dec. 2009，剑桥大学Sanger Center 3. 干细胞研究 北京时间10月8日下午，2012年诺贝尔生理学或医学奖揭晓， 英国科学家约翰·戈登（John B. Gurdon）和日本科学家山中 伸弥（Shinya Yamanaka）获奖，获奖理由为“发现成熟细胞 可被重编程变为多能性”。 c-Myc Klf4 Oct3/4 Sox2 干细胞研究方法 - FCM • FCM应用 • 胞内 • 胞外 • 上清 • 细胞培养 • 分化 • 寻找生物标记 • Stem Cells定性 • Side Population 分析 • Stem Cells分离 干细胞研究 流式细胞术检测SP细胞示例图 4.植物学应用 • 植物细胞周期分析 • 倍性分析 • C值研究 • 抗逆胁迫研究 • 荧光蛋白测定 细胞周期、倍性分析、C值研究 中国农业科学院蔬菜所西兰花倍性鉴定 二倍体 中国农业科学院蔬菜所西兰花倍性鉴定 单倍体 A．流式图谱 - 分选前 GFP+细胞分选 BD FACSAria III分选高表达GFP目的基因的细胞 GFP+细胞分选 BD FACSAria III分选高表达GFP目的基因的细胞 5. 染色体分选 染色体核型分析及分选在遗传病研究，基因文库的建立上起了重要作用；某 些物种的染色体根据其AT和GC含量的不同可以进行区分并分选出来；通过 Hochest/色霉素A3染色，激光器激发核酸染料对染色体进行分析并分离。 人的23对染色体分析图 流式分选仪的原理及应用 • 流式分选的原理 • 流式分选的影响因素 • 流式分选的应用 • 分选流程及注意事项 鞘液 • 必须使用盐离子缓冲溶液作为 鞘液，通常是PBS，不建议使 用生理盐水 • 特别需要维持合适的pH值， 通常为中性 • 无菌分选时，需要高压灭菌鞘 液（建议一直使用无菌鞘液） • 一般不加NaN3 • 注意更换鞘液过滤器 合适样本类型 • 细胞大小一般不超过喷嘴孔径 1/5，绝不能超过1/3 • 建议无菌样本，容易维持上样针 部分的无菌条件 • 减少有高浓度PI的样本，以免残 留在管路内，影响后续样本活性 • 浓度可在107/ml • 一定要使用300-400目孔径过滤 网过滤 分选前 • 建议先进行预实验，调整实验设置，并且预估回 收率，选择合适的样本量 • Ficoll分离过的PBMC使用PBS+ 1% human AB serum 调整浓度到 1–2 x 107 PBMCs/mL 分选中 • 设门去除粘连体细胞 • 正确的分析 • 对于需要后续培养或是对于内毒素特别敏感的细 胞，建议完成无菌分选准备流程 • 选择合适的分选精度 • 选择合适的喷嘴孔径 • 选择合适的上样速度以保证纯度和得率 分选中 • 温度的改变对细胞不利，控制上样舱和收集 的温度 • 一些细胞需要特别的培养基或是血清来维持 活性，加入不超过2%的血清 • pH值的变化同样会对细胞活性有影响，加入 不超过25 mM的HEPES到收集管中有助于维 持pH • 样本的沉降容易导致速度的降低和细胞的聚 集，导致堵塞，样本分选前过滤，可使用混 匀功能或上样管过滤器，减少此类事件发生 收集 • 收集管预先用human AB serum包被，然后加入 0.4 mL X-VIVO 15 培养液 + 10% human AB serum 及 0.2% acetylcysteine（用于培养）， 或是PBS + 1% Human AB serum（仅用于回测） • 选择合适的收集管，并调节分选液流加电，使得 分选液流尽可能打在培养基、PBS、血清的液面 上，而不是管壁 • 收集后的细胞，用250g,10分钟进行离心，小心 取上清，用于后续实验 提升活性 • 减少样本收集前后的处理过程，去除不必要的离 心和重悬 • 减少剪切力效应，轻柔使用移液枪 • 为减少细胞吸附到管壁，收集管使用聚丙烯材质， 并用100% human AB serum包被 • 分选中可暂停，轻柔混匀样本管和收集管，确保 细胞悬浮 分选后 • 分选后回测需要确保前后条件一致，确认进样针 管路无残留 • 对于特别少的样本，容易显得杂质比较多 • 尽量将分选后细胞的洗涤过程减少到1次，并且休 整数小时后再进行培养或是后续处理 分选后回测 BD为您提供专业流式服务 BD流式细胞术培训中心COE（上海，北京） BD每年开展巡回学术讲座（全国各大城市） BD编撰《Flow Cytometry》刊物，不断向客 户传达更多、 更新的流式资讯 BD —— Be With You ! Thanks! BDB 孔祥涛 400-819-9900