Transcript Vírusové vektory

Vírusové vektory
RNDr. Miroslava Matúšková, Ph.D.
Ústav experimentálnej onkológie SAV, Bratislava
Farmakologický ústav, LF MU Brno
1
Základná štruktúra vírusov
Enterovírus
http://www.elu.sgul.ac.uk
Retrovírus
http://www.stanford.edu/group/
2
Vírusový genóm
ds
RNA
DNA
lineárna
cirkulárna
ss
+RNA – RNA pozitívnej polarity, môže slúžiť ako mRNA
-RNA –RNA negatívnej polarity, najprv musí byť prepísaná do + vlákna RNA
závislou RNA polymerázou
Skoré “early“ gény a neskoré „late“ gény
3
Symetria kapsidu
Ikozaéder
Helix
http://www.mcb.uct.ac.za/tutorial/mcb2016f/mcb2016f.htm
4
Vírusové
vektory
DNA
Adenovírusy
RNA
AdenoHerpetické Poxvírusy
asociované
vírusy
vírusy
HSV
Alfavírusy
Retrovírusy
Bakulovírusy
Lentivírusy
MMLV
EBV
5
Vymedzenie základných pojmov
•
Vírusový vektor - syntetický konštrukt obsahujúci určité vírusové sekvencie určený
na prenos genetickej informácie do cieľovej bunky
•
Transfekcia – prenos genetickej informácie pomocou nevírusového vektora
(lipofekcia)
•
Transdukcia - vnesenie genetickej informácie do bunky pomocou vírusového
vektora (nukleová kyselina obsahujúca transgén je vbalená do vírusovej častice)
– transientná – DNA sa neintegruje do genómu hostiteľskej bunky, genetická
modifikácia je dočasná
– stabilná – transgén sa stáva súčasťou genómu hostiteľskej bunky a prenáša sa
pri bunkovom delení do oboch dcérskych buniek
•
Provírus – vírusový genóm integrovaný do chromozómu hostiteľskej bunky
•
Epizóm – cudzorodá genetická informácia v cytoplazme alebo jadre bunky, ktorá sa
replikuje nezávisle od genómu hostiteľskej bunky. Vo virológii sa tento termín používa
pre nukleovú kyselinu, ktorá nie je integrovaná v chromozóme hostiteľskej bunky.
6
•
Vírusové vektory rozdeľujeme na replikačne kompetentné a replikačne
defektné. Genetická informácia je u replikačne kompetentných vírusových
vektorov kompletná a umožňuje realizáciu celého životného cyklu vírusu
v cieľových transdukovaných bunkách. Replikačne defektné vírusy majú
určité sekvencie odstránené, na ich produkciu sú potrebné takzvané
pomocné (helper) bunkové línie alebo pomocné plazmidy, nie sú
schopné množiť sa v cieľových transdukovaných bunkách.
•
Infekcia/transdukcia vírusovým vektorom môže alebo nemusí byť
nasledovaná lytickým cyklom – replikačne kompetentné onkolytické
vektory (odvodené od retrovírusov alebo adenovírusov) usmrtia bunku
počas replikačného cyklu, môžu alebo nemusia niesť gény kódujúce
„toxické“ produkty. Pripravujú sa s cieľom využiť ich v liečbe onkologických
ochorení.
7
Rozdelenie vektorov podľa tropizmu (okruhu hostiteľov)
• Ekotropné
• Amfotropné
• Xenotropné
• Polytropné
• Pantropné
Segura et al. 2011
Tropizmus vírusov závisí od interakcie povrchových štruktúr bunky a vírusu
(receptor-ligand)
8
Základná štruktúra (retro)vírusového vektora
Cirkulárna dsDNA
9
Retrovírusový genóm
Lineárna +ssRNA
10
Štruktúra jednoduchého provírusu
gene of interest
Lineárna dsDNA
Maetzig et11
al 2011
Adenovírusy a adenovírusové vektory
• ~400 zaregistrovaných klinických skúšok
využívajúcich adenovírusové vektory
• Relatívne odolné a stabilné
• Transdukcia deliacich aj nedeliacich sa buniek
• Veľa vektorov je odvodených z AV typu 5 (Ad5)
• Transdukcia je transientná
http://biomarker.cdc.go.kr
• Vysoký titer (1010, po zakoncentrovaní až
1013VP/ml)
• Transdukcia je cieľovými bunkami dobre
tolerovaná (vysoká viabilita buniek po transdukcii)
• Vysoká expresia transgénu
• Vakcíny, génová terapia rakoviny, základný
výskum
• Problém je imunogénnosť
12
Genóm adenovírusov tvorí lineárna dsDNA
Kovesdi et al., 2010
13
Seregin et al 2010
14
• Klonovacia kapacita do 9kbp
• Replikačne kompetentné
(onkolytické) vektory
ONYX-015
E1B-55K
• Replikačne defektné vektory
Vakcíny
Génová terapia
15
Adeno-asociované vírusy a vektory
• Malé ikozaedrálne vírusy
• Na produktívnu infekciu je nutná koinfekcia s
adenovírusom alebo herpetickým vírusom
(Dependovirus)
• Integrujú sa do genómu hostiteľskej bunky –
trvalá transdukcia
• Liečba genetických ochorení
• Protinádorová génová terapia
http://ictvdb.bio-mirror.cn
16
Genóm tvorí lineárna ssDNA ~5kbp
17
AAV vektory
Krűker et al, 2008
18
Herpetické vírusy a odvodené vektory
• Genóm je tvorený lineárnou dsDNA
• Vektory odvodené od HSV, EBV
• Transientná expresia transgénu
• CMV - promótor
• Veľká klonovacia kapacita
• Relatívne nízka imunogenicita
• HSV – neurotropizmus
http://textbookofbacteriology.net
• EBV – lymfotropizmus
• Vakcíny, génová terapia rakoviny
19
Hybridné HSV/EBV vektory – dlhodobá genetická modifikácia
Sia et al. 2010
20
Poxvírusy a odvodené vektory
Vírus vakcínie (nepravých kiahní)
• Genóm tvorí lineárna dsDNA
• Veľké komplexné vírusy
• Replikačný cyklus prebieha v
cytoplazme
• Transientná expresia transgénu
• Veľká klonovacia kapacita
• Bezpečnosť
• Rekombinantné vakcíny,
(protinádorová génová terapia)
21
Retrovírusy a odvodené vektory
Gamaretrovírusy – Moloneyho vírus myšej leukémie MMLV (MoLV, MLV)
Alfaretrovírusy - Vírus Rausovho sarkómu (RSV)
ampR
5` LTR
psi+
pJZ308
7187 bp
GOI
3` LTR
IRES
Silverman et al 2010) doi:10.1038/nrurol.2010.77
neoR
• Integrácia do genómu hostiteľskej bunky
• Stabilná transdukcia
• Vektory odvodené od gamaretrovírusov a alfaretrovírusov transdukujú len deliace sa bunky
• Pripravujú sa ako replikačne kompetentné aj replikačne defektné
22
Replikačne defektné vektory
gag, pol a env môžu byť stabilne v bunkových líniách
23
Príprava replikačne defektného retrovírusového vektora
1.
Naklonovanie požadovaného génu do vektora
2.
Transformácia baktérií
3.
Selekcia bakteriálnych klonov s požadovaným
transgénom (NeoR)
Overenie naklonovaného génu sekvenovaním
Pomnoženie žiadaného klonu
Purifikácia plazmidovej DNA
4.
5.
6.
E. coli
ampR
5` LTR
psi+
pJZ308
7187 bp
GOI
3` LTR
IRES
neoR
24
7.
Transfekcia pomocnej vbaľovacej bunkovej línie
8.
Selekcia transfekovaných buniek (NeoR)
9.
Titrácia vírusu
(ekotropné bunky
10. (Ping-pong)
11. (Titrácia vírusu po ping-pongu)
Amfotropné bunky
12. Transdukcia cieľových buniek
13. Selekcia cieľových transdukovaných buniek (NeoR)
Cieľová
bunka
25
Replikačne kompetentné retrovírusové vektory
U klasickej génovej terapie je
problém dosiahnuť dostatočnú
penetranciu nádoru terapeutickým
vektorom – zlyhanie viacerých
klinických skúšok → použitie
vektorov, ktoré sa v nádorovom
tkanive množia a infikujú ďalšie
maligné bunky
Tai et al., 2010
26
Samoinaktivujúce sa (SIN) retrovírusové vektory
Reverzná transkripcia
•
•
•
•
Delécia v 3’U3 oblasti
(promótor/enhancer)
Pri reverznej transkripcii sa
prepíše do 5’ oblasti
Zníženie rizika inzerčnej
mutagenézy
Expresia transgénu kontroluje
vnútorný naklonovaný
promótor
Coudercet al., 2005
Bosticardo et al., 2009
27
Maetzig et al , 2011
28
Lentivírusové vektory
•
Transdukcia aj nedeliacich sa buniek
•
Zložitejšia štruktúra v porovnaní s MMLV
vektormi
•
Často odvodené od HIV
http://micro.magnet.fsu.edu
29
Vývoj lentivírusových vektorov
Durand et al 2011
30
Alfavírusy a odvodené vektory
• +ssRNA vírusy
• Vysoko účinná transientná transdukcia
• Ako vektory sa používajú Vírus Sindbis, Semliki
forest vírus a Vírus venezuelskej konskej
encefalitídy
• Príprava vírusových vakcín
http://biochem.ncsu.edu
• Afinita k nervovému tkanivu
31
Schéma alfavírusových vektorov
Replikačne
defektný
vektor
Replikačne
kompetentný
vektor
Vektor pre
priamu
transfekciu
32
Bakulovírusy a odvodené vektory
http://www.microbiologybytes.com
Räty et al., 2004
• >1000 zástupcov
• Vírusy bezstavovcov
• Využívané v genetickom inžinierstve
• V ochrane rastlín ako insekticídy
• Bezpečné, druhovo špecifické, in vitro sa množia na hmyzích bunkách
33
Transgény pre génovú terapiu
•
Protinádorová liečba
–
–
–
–
–
•
Imunomodulačné molekuly, cytokíny, chemokíny (IL12, TNFα, IFN)
Gény konvertujúce predliečivo (CD, PNP, HSVtk)
Antiangiogénne molekuly (angiostatín)
Proaptotické molekuly (p53, TRAIL)
Protinádorové vakcíny (PSMA, HPV E6, HPV E7)
Genetické ochorenia
– Vloženie funkčného génu (cystická fibróza, svalová dystrofia...)
•
Imunodeficiencia (adenozín deamináza)
•
Vakcíny (do vektora je vložený gén pre príslušný Ag)
34
Pseudotypovanie vektorov
• Za tropizmus vírusu sú zodpovedné povrchové glykoproteíny (u retrovírusov
env) interagujúce s povrchovými molekulami buniek
• Je možná v podstate ľubovolná zmena tropizmu vírusu
• Najčastejšie sa využíva VSVg
Vírus vezikulárnej stomatitídy VSV
Mononegavirales → Rhabdoviridae → Vesiculovirus
• -ssRNA
• Obalený vírus
• Široký tropizmus
• Používa sa aj ako vektor (napr
génová terapia rakoviny)
http://www.virology.ws
35
Titrácia vírusových vektorov
Vektory, ktoré nespôsobujú lýzu bunky
ampR
5` LTR
psi+
pJZ308
7187 bp
GOI
3` LTR
IRES
neoR
1. Založenie O/N kultúry permisívnych
buniek
2. Príprava vírusového inokula (filtrácia cez
0,45μm filter, desiatkové riedenie)
3. Infekcia buniek
4. Selekcia transdukovaných buniek G418
5. Farbenie (May-Grűnwald)
6. Stanovenie titra v CFU (colony forming
unit)
~7dní
36
Stanovenie titra retrovírusového vektora na bunkách HeLa
počet kolónií x riedenie / objem inokula
2 x 1000/0,9=2,2x103CFU/ml
37
• U lytických vektorov sa používa plaková titrácia
• Infikované bunky sa zalejú agarom alebo metylcelulózou
• Po farbení sa počítajú plaky a titer sa vyjadruje v PFU (plaque
forming unit)
38
Komerčné testy na stanovenie množstva vírusu
•
•
•
96-jamkový formát
Kolorimetrické alebo fluorimetrické vyhodnotenie, výsledok do niekoľko
hodín alebo v priebehu 1-2 dní
Stanovenie aktivity reverznej transkriptázy (Enzchek®)
39
Požiadavky na bezpečnosť
• Pravidlá a legislatíva pre prácu s GMO
• Ochrana pracovníkov aj enviromentu
• Nahlásenie každej kombinácie
konštrukt/geneticky modifikovaný organizmus
(bunková línia)
• MŽP, kontroly
• Retrovírusové a lentivírusové vektory – BSL2
• Ostatné vektory - BSL1
40
41