Transcript Mikroorganismu kultivācija bioreaktoros.

Mikroorganismu kultivācija
bioreaktoros
Dr.sc.eng. Juris Vanags
Kas ir bioreaktors? (1)
Bioreaktors ir iekārta, kas nodrošina apstākļus
mikroorganismu vairošanai un biosintēzei.
Mikroorganismi aug barojošā vidē, no kurienes saņem
nepieciešamo vairošanai. Vēl papildus kā barojošais
elements var tikt izmantots skābeklis, ko pievada ar
saspiestā gaisa palīdzību avi inertās gāzes balona
palīdzību. Lai varētu sekmīgi noritēt mikroorganismu
vairošanās un barības saņemšana, ir nepieciešams
precīzi ievērot ārējās vides apstākļus, jo vairums
biosintēzē izmantojamo mikroorganismu šai ziņā ir
daudz jūtīgāki nekā , piemēram, cilvēki. Tāpēc arī šai
mikroorganismu pasaules mājā - bioreaktorā ir
jānodrošina daudz augstāks “komforta” līmenis, t.i.
Ārējās vides nosacījumi.
Kas ir bioreaktors (2)?
No mikroorganismu šūnām līdz
produktam
Mikroorganismu vairošnās
vienādojums bioreaktorā
Mikrorganismu vairošanas
dinamika
Mikroorganismu kultivāciju veidi








Periodiskais;
Piebarošanas;
Nepārtrauktais.
Periodiskajā procesā bioreaktors tiek piepildīts ar svaigu barotni un tad tajā tiek ievadīts
sējmateriāls. Fermentācijas procesa beigās saturs tiek aizvadīts uz izdalīšanās stadiju,
reaktors iztīrīts un nosterilizēts, lai būtu gatavs nākošajam procesam.
Piebarošanas procesā, bioreaktorā tiek pievadīta nepārtraukti vai porcijās svaiga barotne
(piebarošanas intensitāte parasti tiek saistīta ar augšanas vai biosintēzes ātrumu). Kad
bioreaktors ir pilns, tad tas tiek daļēji vai pilnīgi iztukšots. Process tiek nobeigts vai atjaunots.
Nepārtrauktajā procesa jeb hermostatā nepārtraukti tiek aizvadīta projām bioreaktorā
sakultivētais šķidrums. Nepārtrauktais process var noritēt ļoti ilgi un tā garumu parasti nosaka
ražošanas vajadzības un tehniskie faktori.
Visizplatītākais ir fermentācija ar piebarošanu un tā tiek parasti pielietota bioloģiskajiem
produktiem. Šādā gadījumā tiek novērsti periodisko procesu trūkumi ar ne sevišķi lielām
tehniskām izmaiņām.
Nepārtrauktie procesi jeb hemostati visbiežāk tiek pielietoti bioķīmikālu iegūšanai lielmēroga
ražošanā. Šādi procesi no ražošanas viedokļa ir ekonomiskākie. Kaut gan to pielietošanai ir
nepieciešami būtiski tehniski pārveidojumi un dziļāka izpratne par dotās fermentācijas kinētiku.
Mikrorganismu dažādu
piebarošanas ilustrācija
Laboratorijas bioreaktors
Galvenās prasības bioreaktoram





Galvenās prasības, kas jānodrošina
bioreaktoram, nosacīti var iedalīt 3 grupās:
Sterilitāte;
Samaisīšana/aerācija kā būtisks masas
apmaiņas faktors;
Procesa kontrole un vadība.
Lai varētu izpildīt šīs prasības, bioreaktora
risinājumam ir jābūt veidotam ar atbilstošu
profesionalitāti un tā tehniskajam izpildījumam
(virsmas apstrāde, metinājuma šuves) jābūt
kvalitatīvi augstā izpildījumā.
Sterilitāte (1)
Viens no galvenajiem dažādu bioreaktoru
kvalitātes salīdzināšanas rādītājiem, ir spēja
nodrošināt sterilas fermentācijas. Šīs īpašības
lielā mērā nosaka bioreaktora konstrukcija un
virsmas apstrādes kvalitāte. Visi tālāk uzskaitītie
nesterilitātes riska faktori, galvenokārt ir saistīti
ar hermetizācijas nodrošinājumu dažādās
procesa stadijās un virsmas apstrādes kvalitāti.
Raksturīgākie iespējamie nesterilitātes riska
faktori no konstrukcijas viedokļa ir sekojošie:
Sterilitāte (2)
 Maisītāja blīvslēgi, sensoru un citu ietaišu ievietošanas portu blīvējums.
Viens no tipiskākajiem infekciju piekļūšanas ceļiem ir maisītāja blīvslēgi. Ne
vienmēr ir vienkārši vienlaicīgi nodrošināt efektīvu blīvējumu un netraucētu
piedziņas rotāciju. Vēl bez tam ir jāievēro regulāra piedziņas blīvslēga
kopšana, lai tur nevarētu uzkrāties infekcija. Lai novērstu ar blīvslēgiem
saistītās problēmas, bioreaktoru piedziņas veido uz magnētiskās piedziņas
principa. Šai gadījumā griezes moments tiek pārnests ar magnētiskā lauka
palīdzību un rezultātā bioreaktora trauks var būt pilnīgi noslēgts.
 Attiecībā uz sensoru un citu ietaišu (titrējamo un piebarojamo komponentu
ievadīšanai, parauga noņemšanai, hemostata realizēšanai u.c.) portu
blīvēšanu jāņem vērā, lai to būtu iespējams noblīvēt ar operatora roku
spēku, kā arī, lai nemainītos blīvējuma īpašības sterilizācijas temperatūras
iedarbības rezultātā.
 "Kabatas", nelīdzenumi un citas vājās vietas infekciju uzkrāšanai
bioreaktora trauka iekšpusē. Bioreaktora iekšpusē infekcijas var uzkrāties
vietās, kur ir neregulitātes un nelīdzenumi. Šajās vietās var "paslēpties"
infekciozie mikroorganismi. Tāpēc reaktora iekšpusē dibenam jābūt
noapaļotam, nedrīkst būt asi stūri un virsmām ir jābūt pulētām.
Sterilitāte (3)
 Nepārdomāta" paraugu noņemšana, metodika un
konstrukcija. Noņemot paraugu jāparedz tvaika vai
liesmas padeve un citu apstākļu radīšana, lai pēc
parauga strūklas izbeigšanās infekcija "nepaspētu" iekļūt
fermentācijas šķidrumā.
 Ienākušā un iznākušā gaisa plūsmu filtrācija. Gaisam ir
jāienāk bioreaktorā caur atbilstošas porainības gaisa
filtru, lai aizturētu iespējamo infekciju avotu. Ieejošo
gaisa plūsmu mēdz arī pirms filtrēšanas laist cauri
caurulītēm, kuras tiek karsētas. Tādā veidā mēģina ar
termisko iedarbību vismaz daļēji iznīcināt iespējamās
infekcijas.
Sterilitāte (3)
 Virsspiediena uzturēšana. Svarīgi uzturēt virsspiedienu
(0.2 -0.5 bar) bioreaktora virstelpā (t.i. starp
fermentācijas šķīdumu un bioreaktora vāku), lai radītu
pretestību infekcijas iekļūšanai. Infekcijas nokļūšana
caur izejošā gaisa līniju tiek aizkavēta ar izejas gaisa
filtra izmantošanu.
 Vienmērīga un efektīva siltumpārnese. Tas ir
nepieciešams, lai varētu nodrošināt sterilizācijas
temperatūru ar pēc iespējas vienādu enerģijas patēriņu
un sasilšana būtu vienmērīga. Ja bioreaktora iekšpusē
sasilšana nebūs vienmērīga, tad ir risks, ka būs zonas
trauka iekšpusē, kurās ir nepietiekama sterilizācijas
temperatūra.
Sterilitāte (4)
Vēl bez tam sterilizācijas procesa laikā
sensori, ietaises, savienojumi un citi
mezgli nedrīkst zaudēt savas īpašības.
Tas nozīmē, ka jāizmanto tikai
sterilizējamie sensori (t.i. tādi, kuri
nemaina īpašības pēc sterilizācijas
iedarbības) un blīvējumos jāizmanto
gumija vai citi materiāli, kuru darba
temperatūra nav mazāka par 150°C.
Samaisīšana/aerācija kā būtisks
masapmaiņas faktors (1)
 Gaisa burbuļu disperģēšana;
 Masas pārnese no gaisa burbuļiem (t.i.,




skābekļa piegāde) uz šķidrumu un pēc tam uz
šūnām;
Barotnes sastāvdaļu pievads šūnām (pareizāk
sakot, šūnu aglomeratiem);
Sedimentācijas novēršana;
Siltumapmaiņas nodrošināšana;
Barotnes mazākšķīstošo komponenšu šķīdība.
Samaisīšana/aerācija kā būtisks
masapmaiņas faktors (2)
Kā jau minēts sadaļā "Laboratorijas bioreaktora
uzbūve", visizplatītākā ir standarta Ruštona
turbīnas tipa maisītāji. Tie nodrošina, pie
konstanta maisītāja rotācijas ātruma, vislielāko
ievadīto jaudu. Tas ir praktiski no kultivēšanas
režīmu izvēles viedokļa. Tālāk tiks parādīts, ka
tomēr ir fermentācijas, kurās standarta turbīna
nav vairs labākais risinājums. Protams, ir
fermentācija, kur samaisīšanas loma ir samērā
triviāla. Bet arī šādos gadījumos ir ieteicams
ņemt vērā dažas samaisīšanas/ aerācijas
likumsakarības:
Samaisīšana/aerācija kā būtisks
masapmaiņas faktors (3)
 Maisītāja rotācijas minimālā un maksimālā robeža.





Neatkarīgi no pO2 rādījuma (vai citiem alternatīviem
augšanas vai elpošanas parametriem) nav ieteicams
maisītāja rotācijas ātrumu izvēlēties mazāku par
empīriski noteiktu kritisko robežu nmin. Šo robežu nmin
izvēlas tā, lai neparādītos:
Sedimentācija;
"Mirušās" zonas.
Savukārt, maksimālo maisītāja rotācijas ātruma kritisko
robežu nmax izvēli nosaka šādas parādības:
Putošana;
Šķidruma virsmas fluktuācijas, t.i., "viļņošanās" , un līdz
ar to arī šķidruma iztvaicēšanās.
Samaisīšana/aerācija kā būtisks
masapmaiņas faktors (4)
 Samaisīšanas/ aerācijas attiecības. Izvēloties samaisīšanas un
aerācijas intensitātes vērtības un to savstarpējās relatīvās
attiecības, jāņem vērā sekojošais:
 Skābekļa un citu komponenšu pārneses intensitātes palielināšanai,
vispirms rekomendējam sākt ar maisītāja rotācijas ātruma
palielināšanu un tikai tuvojoties n > nmax sākt pakāpeniski palielināt
aerācijai nepieciešamo gaisa daudzumu Q. Pirms tam Q izvēlas, lai
tiktu nodrošināta stabila aerācija. Parasti, tas ir 1 vvm (vvm pievadītā gaisa daudzuma attiecība pret bioreaktora darba tilpumu).
Tas nozīmē, ja mēs definējam gaisa patēriņu l/min, tad pievadītā
gaisa daudzums Q būs tikpat, cik bioreaktora darba tilpums.
 Pie relatīvi nelieliem maisītāja rotācijas ātrumiem ir jāizvairās
palielināt pievadītā gaisa daudzumu tiktāl, ka sākās "flooding"
efekts. Kas ir "flooding" efekts un kā notiek pāreja tajā no "loading"
stāvokļa vislabāk paskaidros sekojošās ilustrācijas:
Samaisīšana/aerācija kā būtisks
masapmaiņas faktors (5)







Mehānisku, jūtīgu mikroorganismu kultivēšana (pamatā šeit tiks runāts, par
miceliālo mikroorganismu kultivēšanu, jo vēl jūtīgāko šūnu kultūru maisīšanai ir citi
aspekti, t.i., nav pieļaujama šo kultūru maisīšana pat minimālā turbulentā režīmā).
Maisot ar standarta Ruštona turbīnu miceliālo sēņu mikroorganismus, kultivācija
procesā masas apmaiņa palielinās tikai līdz noteiktam maisītāja rotācijas ātrumam,
un palielinot tālāk maisītāja rotācijas ātrumu, masas apmaiņas rādītāji sāk pat
pasliktināties. Iemesls šādai parādībai ir šūnu neatgriezeniskā mehāniskā
sabojāšanās. Šī kritiskā maisītāja rotācija, protams, nav stingri fiksēta, un ir atkarīga
no vairākiem faktoriem:
Mikroorganismu celma paveida;
Barotnes sastāva;
Aerācijas režīma;
Saaugušās biomasas daudzuma (pie lielākas biomasas šis kritiskais maisītāja
rotācijas ātrums parasti kļūst mazāks, jo šādā gadījumā miceliālajiem
mikroorganismiem ir "grūtāk aizbēgt" no lokāli intensīvās samaisīšanas zonas);
Un citiem faktoriem, kas nosaka vides reoloģiskās īpašības un šūnu stāvokli.
Vispārējas prasības laboratorijas
bioreaktoriem (1)
 Jebkuras iekārtas procesu kontroles un vadības
prasības pamatā nosaka konkrētā pielietojuma
specifiskums. Laboratorijas bioreaktora prasības
atšķiras no pilota un rūpnieciska bioreaktora
pielietošanas nosacījumiem ar to, ka
laboratorijas bioreaktorā nav jāparedz
stacionārie pieslēgumi sterilizācijas,
mazgāšanas un citām apkopēm. Laboratorijas
bioreaktora kopējais tilpums ir robežās 2 – 15
litriem. Laboratorijas bioreaktorā tiek kultivēti
mikroorganismi, kā rezultātā tā pielietojumam
tiek noteiktas sekojošās prasības:
Vispārējas prasības laboratorijas
bioreaktoriem (2)






Pirms procesa uzsākšanas bioreaktors un tā pievadi ir jāsterilizē;
Procesa laikā ir jānodrošina sterili nosacījumi, lai kultivējamā vidē
neiekļūtu infekcija;
Lai neveidotos infekcijas perēkļi, iekšējām virsmām ir jābūt
pulētām ar noteiktu gluduma pakāpi un tajās nedrīkst būt asi stūri
un malas vai citāda veida ieslēgumi;
Visiem bioreaktorā ievietotajiem sensoriem ir jābūt sterilizējamiem
vai nosacīti sterilizējamiem, tas nozīmē, ka to īpašības, t.sk. arī
kalibrācijas iestādījumi nedrīkst mainīties pēc sterilizācijas;
No ārpuses dozējamām vielām (pH titranti, putudzēšanas
līdzeklis, piebarošanos barotne) jābūt sterilām un tās jāpievada
sterili. Tāpēc šim nolūkam parasti pielieto peristaltiskos sūkņus;
Aerējamās gāzes (gaiss, skābeklis O, slāpeklis N, ogļskābē gāze
CO) ir jāievada sterili. To parasti nodrošina ar mikrobioloģisko
filtru palīdzību;
Vispārējas prasības laboratorijas
bioreaktoriem (3)



Visiem sensoriem, pievadiem, kā arī motoru piedziņai ir jābūt
noblīvētiem hermētiski. Savienojumu vietās jānodrošina sterili
nosacījumi. Tāpēc, piemēram, maisītājam izvēlas magnētisko
piedziņu, jo mehāniskā blīvējuma gadījumā sterilu savienojuma
nodrošināšanai ir regulāri jāveic pareiza un rūpīga apkope;
Visiem iekšējiem materiāliem jābūt tādiem, lai neveidotos
inhibēšanās. bioreaktora trauka iekšpusē parasti ir akceptējami
nerūsējošais tērauds, borsilikāta stikls un teflons. Pie tam parasti
tiek akceptēta tikai nerūsējošā tērauda marka 316 L, jo tās
piemaisījumi arī metinājuma vietās nodrošina pietiekošu inertumu
attiecībā pret kultivējamo vidi.
Bioreaktora ārpusē un ārējos pievados jābūt līdzīgiem
materiāliem, lai novērstu kontaktpotenciālu starpības izraisītās
sekas. Kaut gan ārpusē šie nosacījumi nav tik strikti. Tā,
piemēram, ārpusē var tikt pielietotas nerūsējošā tērauda markas
arī ar lielāku piemaisījumu daudzumu. Visizplatītākā marka šai
ziņā ir 304.
Laboratorijas bioreaktora sterilizācija
 Uz bioreaktora vāka daļas pievienot visus nepieciešams sensorus








un palīgierīces, ņemot vērā hermētiskuma un aseptikas
nosacījumus.
Atvienot visus kabeļus no sensoriem.
Noņemt elektrodzinēju no vāka.
Nostiprināt ar spailēm visus silikona cauruļu brīvos galus (pēc
iespējas tuvāk galiem).
Novietot bioreaktora trauku autoklavēšanai.
Veikt sterilizāciju autoklavējot.
Kad sterilizācija pabeigta un bioreaktora trauks ir atdzisis, izņemt to
no autoklavēšanas un uzlikt uz darba virsmas.
Pievienot kabeļus sensoriem, kabeļus pieslēgt bioprocesu
kontrolierim.
Barotne ir jāsterilizē atsevišķi un to ievada bioreaktorā ar
peristaltiskā sūkņa palīdzību vai pa vāka portu caur liesmu.
Pilota mēroga bioreaktors
Vienreizējās lietošanas
bioreaktors
Vienreizējās lietošanas
bioreaktors
Bioreaktora kontroles un vadības
blokshēma
Bioreaktora vadības shēma
Laboratorijas bioreaktora procesu
kontroles principi un prasības (1)







Procesu kontrolei bioreaktorā ir jānodrošina apstākļi
mikroroorganismu augšanai, ņemot vērā vispārējās
prasības laboratorijas bioreaktoram un atbilstošus
procesu kontroles principus.
Parasti galvenie kontroles un vadības parametri
bioreaktorā ir:
Temperatūra kultivējamā vidē;
2. Vides skābums – pH;
3. Izšķīdušā skābekļa parciālais spiediens – pO2 ;
4. Putu dzēšana;
5. Maisītāja rotācijas ātrums.
Laboratorijas bioreaktora procesu
kontroles principi un prasības (2)
Vēl bez iepriekš minētajiem parametriem dažkārt tiek
kontrolēti ievadītā gaisa un citu gāzu daudzums,
virsspiediens, izšķīdušā oglekļa parciālais spiediens –
pCO2, redoksa potenciāls - eH. Tādi svarīgi
fermentācijas parametri, piemēram, kā glikozes un
biomasas koncentrācija tiek mērīti tikai speciālos
gadījumos, jo to realizācija ir specifiska un dārga.
Dažkārt tiek mērīta arī skābekļa O2 un ogļskābās
gāzes CO2 koncentrācijas izejošā gaisa plūsmā. Citu
parametru kontrole un vadība ir atkarīga no konkrēta
procesa uzdevumiem. Tā piemēram, fermentācijās,
kurās kā produktu iegūst etilspirtu, tiek nepārtraukti
mērīta arī etanola koncentrācija.
Laboratorijas bioreaktora procesu
kontroles principi un prasības (2)





Procesu kontrolei un vadībai bioreaktorā ir sekojošie speciālie
nosacījumi:
Sensoriem un izpildmehānismiem jāatbilst vispārējām prasībām
laboratorijas bioreaktoriem (t.i. materiālu izvēles un sterilitātes
nosacījumi);
Procesu vadībai jānodrošina augsta stabilitāte un drošums, jo procesa
pārtraukšana vai tā nepareiza vadība var nedot iespējas atjaunot procesa
norisi, jo kultivējamā mikroorganisma augšana būs neatgriezeniski
pārtraukta;
Procesu norise un reakcija uz ārējām iedarbībām ir samērā lēna un bieži
arī inerta. Ņemot vērā vēl arī to, ka mikroorganismu kultivācijā nav
vēlama vadāmo parametru pārregulācija arī uz īsu brīdi, tad regulācijas
parametri jāiestāda rēķinoties ar samērā lēnu iedarbi;
Iekārtas apkalpošanas lietotāja interfeisam jābūt draudzīgam, t.i. relatīvi
vienkāršam un lietotājam saprotamam, jo lēmumi par parametru maiņu ir
jārealizē samērā operatīvi un nekļūdīgi. Vēl jāatzīmē, ka bioreaktorus
bieži apkalpo personāls ar bioloģiska, t.i. netehniska, rakstura izglītību.
Procesu regulācijas likumsakarības
bioreaktoros
Laboratorijas bioreaktora procesi var tikt kontrolēti ar
saksņā ar dažādiem algoritmiem – PID, autonokaņošanās, fuzzi loģika, u.c. Galvenais uzdevums ir
atrast optimālo kontroles un vadības variantu. Tāpēc arī
papildus šiem algoritmiem vadības programmās tiek
definēti limitējošie faktori, loģiskie un citi nosacījumi.
Visizplatītākā ir PID (t.i. Proporcionāli –Integrāli –
Diferenciālais) algoritma pielietošana. To uzskatāmi var
aprakstīt ar sekojošo formulu:
 m = KC(e + 1/TI ∫ edt + TD de/dt )
 kur:
 m – izejas signāla iedarbība uz raksturojošo izpildmehānismu;
 e – starpība strap iestādījuma vērtību (t.i. Set point) un reālo
vērtību; TI – integrālais laiks; TD – diferenciālais laiks.
Temperatūras kontrole un vadība
(1)




Temperatūra tiek mērīta bioreaktora trauka kulturšķīduma vidē.
Bioreaktoros tiek izmantoti Pt100 temperatūras sensori, kuru
garums un konfigurācija ir piemēroti dotajam bioreaktoram.
Temperatūras sensoram jābūt iegremdētam pietiekoši dziļi, jo
fermentācijas laikā kultūršķidruma līmenis var būtiski mainīties.
Temperatūras vadība notiek bioreaktora trauka ārpusē.
Laboratorijas bioreaktoriem parasti tiek realizēts, cirkulējot caur tā
caur tā apvalku termostatējam šķidrumam.
Uzsākot procesu, jābūt iestādītai nepieciešamajai temperatūrai
(set point) , regulācijas mirušajai zonai (dead zone), termostata
pārkaršanas temperatūrai, temperatūras trauksmes novirzei un
PID regulācijas parametriem.
Saskaņā ar PID algoritmu un iestādīto temperatūru tiek
ieslēgts/izslēgts termostata sildītājs vai elektromagnētiskais
dzesēšanas vārsts. Cirkulācijas sūknis darbojas nepārtraukti.
Termostata shēmas variants ir parādīts nākošajā slaidā.
Temperatūras kontrole un vadība (3)




Termostatā notiek regulējošas iedarbības, ja temperatūras vērtība ir
ārpus robežām: [TSetPoint – dead zone; TSetPoint + dead zone]. Dead
zone izvēlas atkarībā no nepieciešamās temperatūras regulācijas
precizitātes. Parasti laboratorijas bioreaktoriem tā ir robežās : 0.2 – 0.50
C.
Termostata pārkaršanas temperatūras kontrole ir nepieciešama, lai
nepieļautu termostata pārkaršanu, kas var notikt piemēram, ja kāda
iemesla dēļ ir apstājusies cirkulācija termostatā. Termostata pārkaršanas
temperatūru rekomendējams mērīt ar neatkarīgu kontrolieri, lai novērstu
avārijas situāciju arī gadījumā, ja ir kļūme procesa kontrolierī. Dažos
gadījumos pielieto arī bimetāla kontakta slēdzi, kurš atslēdzas, ja tiek
pārsniegta šī slēdža pārslēgšanas temperatūra.
Sasniedzot trauksmes temperatūru tiek izdots avārijas signāls.
Trauksmes temperatūru iestāda, kā novirzi abos virzienos no
nepieciešamās temperatūras. Parasti šo novirzi iestāda robežās : 1 – 20
C.
Uzsākot procesu svarīgi, lai termostats būtu piepildīts ar ūdeni. Šim
nolūkam ieslēdzot temperatūras regulēšanas procesu, tiek uz brīdi (apm.
Uz 30 sekundēm) ieslēgts dzesēšanas vārsts.
pH definēšanas princips
 Pēc būtības pH devējs mēra ūdeņraža jonu H+ aktivitāti.




pH vērtība ir definēta kā negatīvais logaritms no
ūdeņraža jonu aktivitātes:
Tātad pH ir skaitlis, kas apraksta šķīduma skābuma (H+)
vai sārmainuma (OH-) pakāpi. pH izmaiņu mērogu
nosaka ūdens molekulu spēja sadalīties jonos:
H 2O→H+ + OHTā, piemēram, pie T = 25 0C, ja pH ir 0, tad α H+=1, bet
α OH- =10-14, bet, ja pH =14, tad αH+=10-14, bet α OH=1.
Savukārt, ja α H+ = α un OH- = 10-7, tad pH =7, kura tiek
dēvēta par neitrālu pH vērtību un izopotenciālo punktu.
pH saistība ar H jonu aktivitāti
pH sensora princips un uzbūve (1)
pH sensora un princips uzbūve (2)
 pH mērīšanas princips balstās uz potenciālu starpības mērīšanu
starp mēr- un bufera elektrodu, saskaņā ar attālināto shēmu. Buferu
elektrods atrodas neitrālā pH vidē. Mūsdienās parasti mēr- un
bufera elektrodi tiek ievietoti vienā korpusā, un šādā izpildījumā tas
tiek saukts par kombinēto pH elektrodu. Šādā konstrukcijā parasti
bufera elektrods sastāv no atskaites elementa Ag/Ag Cl ar sudraba
jonu barjeras, kurš tiek iegremdēts sudraba jonus saturošā
elektrolīta šķīdumā.
 Šim elektrolītam ir jābūt kontaktā ar mērāmo vidi caur šķidruma
pāreju. Visizplatītākā ir poraina keramiska pāreja. Mērelektroda
būtisks elements pH jūtīga (t.i., H+ un OH- jonu) stikla membrāna.
Šīs stikla membrānas izvēle ir atkarīga no pielietojuma. Tā,
piemēram, sterilizējamo elektrodu būtība slēpjas atbilstošas stikla
membrānas izvēlē
Kombinētais pH elektrods
pH atkarība no temperatūras un kalibrācija
 Ķīmiskā līdzsvara nosacījumi šķīdumā ir atkarīga no
temperatūras. Jo pH vērtība ir tālāk no izopotenciālā
punkta, jo atkarība no temperatūras kļūst lielāka. Tā,
piemēram, ja pH =4 pie 25 0C, tad pie 350C atšķirība būs
0.18 pH vienības, bet pie 55 0C tā būs 0.55 pH vienības.
 Tāpēc pH devēja signāla apstrādes shēmā tiek ņemta
vērā temperatūras korekcija. Temperatūras sensors var
būt izvietots atsevišķi vai arī iekombinēts pH elektrodā.
 pH elektrodu pirms katras fermentācijas ir jākalibrē. To
parasti veic ar divu buferšķīdumu palīdzību. Viens
buferšķīdums tiek izvēlēts atbilstošs izopotenciālajam
punktam (t.i., pH=7), bet otrs tiek izvēlēts atkarībā no tā,
kādās robežās un virzienos mainīsies pH procesa laikā.
pH atkarība no temperatūras
pH kontrole un vadība bioreaktorā
(1)



pH devējs parasti tiek iegremdēts laboratorijas bioreaktorā, un no
procesu kontroliera tiek padoti vadības signāli uz skābes vai
sārma titranta peristaltiskajiem sūkņiem atbilstošā pH titrējamā
šķīduma iedozēšanai. pH kontrolei un vadībai ir jāievēro
sekojošais:
Uzsākot procesu, jābūt iestādītai nepieciešamajai pH vērtībai (set
point) , regulācijas mirušajai zonai (dead zone), pH trauksmes
vērtībai un PID regulācijas parametriem. Procesa laikā vēlams
uzskaitīt iedozēto titrantu daudzumu.
Saskaņā ar PID algoritmu un iestādīto pH vērtību tiek
ieslēgti/izslēgti attiecīgo pH titrantu (skābes vai sārma)
peristaltiskie sūkņi. Parasti pirms procesa tiek ieregulēts sūkņa
rotācijas ātrums, kas atkarīgs no vēlamās minimālās un
maksimālās dozas lieluma. Dažkārt izmanto sūkņus ar analogo
ieeju. Tādā gadījumā var nodrošināt nepārtrauktu pH titranta
dozāciju, laikā mainot sūkņa dozācijas ātrumu.
pH kontrole un vadība bioreaktorā (2)



Uz peristaltiskajiem sūkņiem notiek regulējošas iedarbības, ja pH
vērtība ir ārpus robežām: [pHSetPoint – dead zone; pHSetPoint +
dead zone]. Dead zone izvēlas atkarībā no nepieciešamās pH
regulācijas precizitātes. Parasti pH mirušo zonu izvēlās samērā
lielu , t.i. apmēram ap 0.5 pH vienībām, jo nav vēlama titrantu
pārdozēšana. Bez tam nav tik viegli noteikt ar lielāku precizitāti
optimālu procesa pH vērtību.
Sasniedzot trauksmes pH vērtību tiek izdots avārijas signāls.
Trauksmes temperatūru iestāda, kā novirzi abos virzienos no
nepieciešamās pH vērtības. Parasti šo novirzi iestāda robežās ap
0.5 pH vienības.
Iedozēto titranta daudzumu nosaka, izejot no peristaltiskā sūkņa
ieslēgšanās laika noteikšanas. Pirms procesa tiek uzņemta
sakarība starp iedozēto daudzumu un dozācijas laika pie
fiksētiem sūkņa rotācijas ātrumiem.
pH vadības shēma
Putu kontroles principi
 Daudzās fermentācijās ir tipiska putu parādīšanās procesa laikā.
Putu veidošanās procesam progresējot lielākā daļa no
kultūršķīduma var tikt pārvērsta putās, kas praktiski nozīmē
fermentācijas norises pārtraukšanu. Putu parādīšanās parasti tiek
konstatēta ar putu sensora palīdzību. Tā princips ir
elektrovadītspējas mērīšana. Parasti procesa laikā netiek reģistrēta
putu vadītspēja, bet pirms procesa vai procesa laikā tiek ieregulēts
putu parādīšanās slieksnis.





Ir iespējami 3 automātiskie putu dzēšanas varianti:
Ķīmiskais;
Mehāniskais;
Kombinētais.
Ķīmiskās putu dzēšanas
kontrole un vadība
 Ķīmiskajā putu dzēšanas variantā tikko parādās signāls no putu devēja
pārveidotāja, tā sākas putu dzēšana, kontrolierim padodot vadības
signālus uz putu dzēsēja peristaltisko sūkni.
 Kā putu dzēšanas līdzeklis tiek izmantota piemērota eļļa vai sintētiskais
šķīdums. Putu dzēsēja pārdozēšana ir nevēlama, jo tādā gadījumā
būtiski var samazināties mikroorganismu augšanas ātrums.
 Putu regulēšana parasti nenotiek saskaņā ar PID algoritmu, bet ar
pastāvīgu putu dzēsēja impulsu padevi izmantojot peristaltisko sūkni.
Pirms procesa vai procesa laikā ieregulē impulsa un pauzes garumu.
Pauzei jābūt pietiekami lielai (vismaz 30 sekundes), lai putu dzēsēja
iedarbība varētu paspēt atstāt iespaidu.
 Pirms procesa tiek novērtēts kritiskā putu dzēšanas līdzekļa daudzums.
Šai nolūkā, tas procesa laikā tiek uzskaitīts. Rekomendējam izdot
trauksmes signālu un apstādināt putu dzēšanu, ja tā daudzums ir
pārsniedzis kritisko daudzumu (nosaka kā putu dzēšanas peristaltiskā
sūkņa darbības laiku).
Mehāniskās putu dzēšanas
kontrole un vadība
 Dažos fermentatoros ir iebūvēta papildus augšējā
piedziņa putu mehāniskajai dzēšanai. Agrāk tādas bija
gandrīz katram laboratorijas bioreaktoram.
Pilnveidojoties putu ķīmiskās dzēšanas metodēm, putu
mehāniskā dzēšana tiek pielietota mazāk.
 Tikko parādās signāls no putu devēja pārveidotāja, tā
sākas putu dzēšana, kontroliera vadības signālam
ieslēdzot putu dzēšanas piedziņu. Kad putu devēja
signāls liecina, ka vairāk putu nav, tad ar laika aizturi
putu dzēšanas dzinējs izslēdzas.
Kombinētās putu dzēšanas
kontrole un vadība
 Kombinētajā putu dzēšanas variantā papildus putu dzēšanas
signālam tiek arī kontrolēts putu strāvas pārsniegšanas releja
bloks. Šī releja princips balstās uz to, ka pieaugot putu
intensitātei palielinās motora strāva. Ar potenciometra palīdzību
tiek ieregulēts slieksnis pie kura parādās signāls bloka izejā, kas
liecina par putu intensitātes palielināšanos.
 Parādoties putām vispirms notiek mehāniskā putu dzēšana.
Nostrādājot putu strāvas relejam tiek papildus uzsākta ķīmiskā
putu dzēšana saskaņā ar iepriekš aprakstīto principu.
Samazinoties putām, par ko liecina putu dzinēja releja
izslēgšanās, tiek pārtraukta putu ķīmiskā dzēšana. Pazūdot
putām, par ko liecina putu devēja pārveidotāja signāla pasīvā
stāvokļa vērtība, tiek pārtraukta arī putu mehāniskā dzēšana.
pO2 fizikāli ķīmiskais princips
Gāzes šķīdības pakāpe šķidrumos var būt atšķirīga. Šī
šķīdība saskaņā ar Henrija likumu ir līdzsvarā ar gāzes
spiedienu virs šķidruma. Fermentācijas procesos,
mikroorganismiem vairojoties, tie patērē skābekli, kas
tiek ievadīts ar aerēto gāzi. Šis skābeklis no gaisa
burbuļa izšķīst šķidrumā, t.i. barotnes vidē, un tad no
barotnes, tas nokļūst pie mikroorganismiem. Barotnē līdz
ar to mainās skābekļa koncentrācija, kas atkarīga gan no
šķīdības, gan no mikroorganismu augšanas ātruma. Tā
rezultātā mainās barotnes vidē izšķīdušā skābekļa
parciālais spiediens pO2. Skābekļa šķīdību varam mainīt
ar maisītāja rotācijas ātrumu, ievadīto skābekļa
daudzumu, cukura avota koncentrāciju.
Masas apmaiņas ilustrācija
bioreaktorā
pO2 sensora uzbūves princips (1)
pO2 mērīšanas balstās uz strāvas vērtības
maiņu starp anodu un katodu atkarībā
no izšķīdušā skābekļa daudzuma
elektrolīta vidē. Skābeklis O2 nokļūst
elektrolītā caur gāzu caurlaidīgu
membrānu. Attēlotajā sensora shēmā
anods ir no sudraba (Ag), bet katods
no svina (Pb). Elektrolīts ir KCl vai cits
šķīdums ar augstu pH vērtību.
Attēlotajās shēmās ir elektrodu
polarogrāfiskais un galvaniskais
slēgums. Polagrāfiskā slēguma
priekšrocība ir tā, ka mainot
sprieguma vērtību var iegūt optimālu
sakarību starp strāvu I un spriegumu
U. Uopt = 0.6 – 0.8 V. Savukārt
galvaniskā slēguma varianta
priekšrocība ir tā, ka svins netiek
reducēts uz katoda un ūdeņraža
sulfīda izraisītie elektroda bojājumi ir
mazāk kritiski.
pO2 sensora uzbūves princips (2)
Dotajā grafikā ir parādītā pO2
elektroda sakarība starp strāvu
I un spriegumu U ievietojot
elektrodu attiecīgi slāpekļa
(N2), gaisa un skābekļa vidē
O2. Piesātinājuma strāva I ir
tieši proporcionāla skābekļa
koncentrācijai.
Sterilizējama pO2 sensora uzbūve
pO2 kontroles principi un veidi (1)
Izšķīdušā skābekļa parciālo spiedienu pO2 var
kontrolēt ar sekojošo lielumu vadību:
 Maisītāja rotācijas ātrums n;
 Ieejas gaisa plūsma Q;
 Skābekļa bagātināšanas impulsi;
 Substrāta piebarošana;
 Gāzes maisījumi (Q gaiss, skābeklis O2,
slāpeklis N2);
 Virsspiediens;
 Kaskādes kontrole.
pO2 kontroles principi un veidi (2)
Visos variantos vispārīgais regulēšanas princips ir līdzīgs.
Vispirms tiek iestatītas pO2 vērtības - nepieciešamās
vērtības SP (Set Point) un „mirušo” zonu DZ (Dead
Zone). Atbilstošais izpildmehānisms iedarbojas uz
procesu tādā veidā, lai pO2 vērtība tiktu turēta
diapazonā SP – DZ < pO2 < SP + DZ. Ja pO2 vērtība
atrodas minētajā diapazonā, tad izpildelements
nedarbojas, ja ārpus diapazona, tad izpildelements tiek
vadīts saskaņā ar PID algoritmu. Visos gadījumos,
izņemot skābekļa padeves impulsu, attiecīgais
izpildelements tiek vadīts ar proporcionālu vadības
signālu (4 – 20 mA vai 0 – 10V). Katra izpildelementa
vadības principi ir rezumēti turpmākajos slaidos.
pO2  f (n) ~ n
pO2 kontrole ar maisītāja rotācijas ātrumu n
Regulēšanas sakarība:
pO2 = f (n) ~ n ,
kur n- maisītāja rotācijas ātrums.
Izpildelements: Elektromotors ar
piedziņas elementiem
pO2  f (n) ~ n
pO2 kontrole ar ieejas gāzes plūsmu Q
Regulēšanas sakarība:
pO2 = f (Q) ~ Q ,
kur Q – ieejas gāzes plūsma
Izpildelements: Ieejas gaisa
regulējošais proporcionālais
vārsts
pO2  f (n) ~ n
pO2 kontrole ar skābekļa bagātināšanu
Regulēšanas sakarība:
pO2 = f (RO2) ~ RO2 ,
kur RO2 - skābekļa padeves
vārsta impulsa biežums
Izpildelements:
Elektromagnētiskais vai
pneimatiskais skābekļa padeves
vārsts
pO2  f (n) ~ n
pO2 kontrole ar substrāta padevi
Regulēšanas sakarība:
Ir iespējamas diva veida substrāta
iedarbes uz pO2 :
1. pO2 = f (S) ~ S ,
2. pO2 = f (S) ~ 1/S
kur S - substrāta padeves
plūsmas ātrums
Izpildelements:
Proporcionālais vai ar impulsiem
vadāms peristaltiskais sūknis
pO2  f (n) ~ n
pO2 kontrole ar gāzes maisījumu palīdzību
Regulēšanas sakarība:
pO2 = f (Qair , QO2, QN2) ~ Qair ~
QO2 ~ 1/QN2
kur Qair , QO2, QN2 - attiecīgi gaisa,
skābekļa un slāpekļa gāzu
plūsmu ātrumi
Izpildelements:
Gaisa, skābekļa un slāpekļa
proporcionālie ieejas vārsti
pO2  f (n) ~ n
pO2 kontrole ar virsspiediena palīdzību
Regulēšanas sakarība:
pO2 = f (P) ~ P
kur P – virsspiediens bioreaktorā
Izpildelements:
Proporcionāli vadāms izejas
vārsts
pO2 kontrole saskaņā ar kaskādes principu (1)
Šajā gadījumā pO2 regulācija var notikt ar dažādām kaskādēm. Katrā
kaskādē regulācija notiek saskaņā ar iepriekš aprakstītajiem veidiem.
Ir iespēja izvēlēties jebkuru no aprakstītajām kaskādēm, kā arī noteikt
jebkuru to sekošanas secību.
Kaskādes regulācija darbojas saskaņā ar sekojošajiem principiem:

Pirms procesa sākšanas tiek nodefinēts, kuras kaskādes un kādā
secībā piedalīsies regulācijā. pO2 vadība sākas ar pirmo kaskādi.
Process attiecīgajā kaskādē tiek kontrolēts tikmēr, kamēr netiek
sasniegta regulējošā elementa limitējošā vērtība. Ja tiek
sasniegta regulējošā vērtība, tad notiek pāreja uz nākošo vai
iepriekšējo kaskādi atkarībā no tā, kura (min vai max) limitējošā
vērtība sasniegta. Pāreja uz citu kaskādi notiek pēc noteikta
„aiztures” laika. Pāreja uz nākošo kaskādi nevar notikt, ja tekošā
kaskāde ir pēdējā. Tāpat nevar notikt, ja esošā kaskāde pēc
skaita ir pirmā.
pO2 kontrole saskaņā ar kaskādes principu (2)


Katra kaskāde var tikt apstādināta (pause) vai pārtraukta (stop).
Ja kaskāde tiek pārtraukta, tad tiek „iesaldēts” vadāmā elementa
stāvoklis, un atjaunojot procesa regulāciju, tā sākas no tā
izpildelementa stāvokļa, kur tā tika apstādināta. Ja kaskādes
regulācija tiek pārtraukta, tad regulāciju atjaunojot, tā sākas no
jauna ar pirmo kaskādi.
Regulācija konkrētajā kaskādē sākas ar noteiktu izpildelementa
stāvokli. Šis stāvoklis atbilst kādai no limitējošām vērtībām.
Sasniedzot limitējošo vērtību notiek pāreja uz nākošo vai
iepriekšējo kaskādi. Izpildelements turpina darboties nākošajā
kaskādē ar tā pēdējo stāvokli. Izņēmums vienīgi ir substrāta
piebarošanas sūknis, kurš citās kaskādēs tiek izslēgts (Ps = 0).
pO2 kontroles kaskādes piemērs: režīmu (n, Q, S)
evolūcija augoša skābekļa patēriņa gadījumā
pO2 kontroles kaskādes piemērs: režīmu (S, Q, n)
maiņa dilstoša skābekļa patēriņa gadījumā