Transcript Biología Molecular Básica para el Patólogo

GRUPO DE PATÓLOGOS DEL NOROESTE
REUNIÓN ACADÉMICA 2013
BIOLOGÍA MOLECULAR BÁSICA PARA EL
PATÓLOGO
Luis Muñoz Fernández
Centenario Hospital Miguel Hidalgo
Biopath México
Aguascalientes, Ags.
López-Corella E. Patología 1991; 29: 65-66.
EL CONOCIMIENTO DEL CÁNCER A
LOS LARGO DEL TIEMPO
DeVita VT et al. Primer of the Molecular Biology of Cancer 2011: 4-5.
EL CONOCIMIENTO DEL CÁNCER A
LOS LARGO DEL TIEMPO
De Vita VT el al. Primer of the Molecular Biology of Cancer 2011: 4-5.
LiVolsi V, Upton MP. Am J Clin Pathol 2012;137: 341-342.
DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.
BIOMARCADORES
• Es una característica que se mide objetivamente
como un indicador de:
• Un proceso biológico normal.
• Una enfermedad.
• Las respuestas farmacológicas a una intervención
terapéutica.
• Tipos:
• Biomarcador pronóstico: evolución.
• Biomarcador predictivo: sensibilidad a cierto tratamiento.
• Biomarcador de monitorización: respuesta a un
tratamiento.
Jaffe CC. Arch Pathol Lab Med 2009; 133: 547-549.
BIOMARCADORES
• Biomarcadores pronósticos:
• La mayoría de los que detectamos en patología.
• Un buen ejemplo son los índices mitósicos o de
proliferación (PCNA, Ki 67).
• Biomarcadores predictivos:
• Her2-neu en cáncer de mama.
• Mutación de KRAS en cáncer de colon.
• Biomarcadores de monitorización:
• Fluorodesoxiglucosa en tomografía por emisión
de positrones (PET scan).
Jaffe CC. Arch Pathol Lab Med 2009; 133: 547-549.
BIOMARCADORES PRONÓSTICOS EN
NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS
Bahler D. Molecular Pathology of Hematolymphoid Diseases 2010: 66.
FIJADORES USADOS EN PATOLOGÍA
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 251.
TÉCNICAS MOLECULARES EN TEJIDOS FIJADOS
EN FORMOL Y EMBEBIDOS EN PARAFINA
• Hibridación in situ fluorescente o
cromógenica (FISH, CISH).
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
• Secuenciación del ADN.
• Pruebas en ARN, como la PCR con
transcripción reversa (RT-PCR).
• Microarreglos para determinar la expresión
génica.
Dry, S et al. Am J Clin Pathol 2012; 137: 346-355.
DEGRADACIÓN DEL ADN EN TEJIDOS FIJADOS
EN FORMOL Y EMBEBIDOS EN PARAFINA
• Para los estudios moleculares, el tiempo de
fijación en formol debe ser entre 6 y 24 horas.
• El formol establece enlaces cruzados con el ADN,
las histonas y otras proteínas, fraccionando las
moléculas:
• Este proceso prosigue en los bloques tisulares a
lo largo de los años:
• Después de 10 a 20 años, la degradación puede
impedir la amplificación con PCR.
Dry, S et al. Am J Clin Pathol 2012; 137: 346-355.
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008; 132: 250.
PROTOCOLOS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.
EXTRACCIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Hunt JL , Sanja D. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 70.
FLUJO UNIDIRECCIONAL EN EL LABORATORIO DE PATOLOGÍA
MOLECULAR
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008, 132: 256.
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 67.
REACTIVOS DE LA PCR
• Polimerasa termoestable: Taq polimerasa u
otra:
• Pfu, Pwo, Tgo, Tli, Tth.
•
•
•
•
Cebadores (primers).
Desoxinucleótidos.
Solución amortiguadora (buffer).
Magnesio.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 77-78.
PCR
Hunt JL. Arch Pathol Lab Med 2008 132: 254.
PCR: CICLOS TÉRMICOS
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 75.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 74.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 75.
DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS DE
LA PCR (“AMPLICONES”)
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 62.
VARIEDADES DE PCR
•
•
•
•
Hot start: mayor especificidad.
Nested: mayor producción y especificidad.
Específica para metilación.
Multiplex: se amplifican varias regiones
simultáneamente.
• PCR con transcripción reversa (RT-PCR):
amplificación de secuencias de ARN.
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 78-79.
PCR EN TIEMPO REAL
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 80.
PCR EN TIEMPO REAL
Dwight O. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 80.
MATRICES DE ADN (MICROARRAYS)
Quackenbush J. N Engl J Med 2006, 354: 2463-2472.
MATRICES DE ADN (MICROARRAYS)
http://www.columbia.edu/~bo8/undergraduate_research/projects/sahil_mehta_project/work.htm
APLICACIONES DE LAS MATRICES DE ADN
Blakey GL, Farkas DH. Basic Concepts of Molecular Pathology 2009: 66.
Perou ChM et al. Nature 2000, 406: 747-752.
PERFILES DE EXPRESIÓN GENÉTICA EN CANCER DE MAMA
Lester SC. Pathologic Basis of Disease 2010.
ONCOTYPE PARA CÁNCER DE MAMA
http://www.oncotypedx.com/en-US/Breast.aspx
CÁNCER COLORRECTAL:
UNA ENFERMEDAD HETEROGÉNEA
• Diferentes vías moleculares de la carcinogénesis:
• Vía supresora convencional (60%):
• APC/β-catenina/Wnt.
• Vía de inestabilidad hereditaria de microsatélites (Lynch,
2 al 7%) :
• MSH2, MLH1, MSH6, PSM2.
• Vía de la mucosa aserrada (35%):
• Silenciamiento epigenético (metilación de islas CpG). TGFβ y BAX.
Shi Ch, Washington K. Am J Clin Pathol 2012, 137: 847-859.
Shi Ch, Washington K. Am J Clin Pathol 2012, 137: 847-859.
TRATAMIENTO DEL CARCINOMA DE PULMÓN
QUE NO ES DE CÉLULAS PEQUEÑAS (NSCLC)
• La neoplasia maligna que se diagnostica con
mayor frecuencia en el mundo.
• Más del 50% de los pacientes están en etapa
IV cuando se les hace el diagnóstico.
• En el 10 al 15% de los casos de carcinoma que
no es de células pequeñas (NSCLC) existen
mutaciones del EGFR: gefitinib, erlotinib.
• Rearreglos del gen ALK (gen de fusión EML4ALK) en el 5% de los NSCLC: crizotinib.
Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.
Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.
TRATAMIENTO DEL CARCINOMA DE PULMÓN
QUE NO ES DE CÉLULAS PEQUEÑAS (NSCLC)
• La mutación de KRAS es un predictor
negativo de las mutaciones de EGFR y de los
rearreglos de ALK.
• La amplificación de MET se asocia a la
resistencia al tratamiento con inhibidores de
EGFR.
Aisner DL, Marshall CB. Am J Clin Pathol 2012, 138: 332-346.