Transcript Patogeneza reumatoidalnego zapalenia stawów: rola szpiku kostnego

Patogeneza reumatoidalnego
zapalenia stawów:
rola szpiku kostnego
Włodzimierz Maśliński
Zakład Patofizjologii i Immunologii
Instytut Reumatologii
Warszawa
Zdrowy staw
RZS
chrząstka
Zdrowa błona maziowa
Spoczynkowe:
Synowiocyty makrofagalne
Synowiocyty fibroblastyczne
Zdegradowana:
chrząstka
kość
Płyn stawowy RZS
Błona maziowa w RZS
Aktywowane:
synowiocyty makrofagalne
synowiocyty fibroblastyczne, makrofagi,
limfocyty T, limfocyty B, komórki: NK,
Aktywowane:
Granulocyty, limfocyty T,
limfocyty B, makrofagi
komórki NK, płytki krwi
tuczne, plazmatyczne, angiogeneza
Modified from Panayi et al. NEJM, 2001;344:907-16
Obrzęk szpiku i nacieki komórkowe w RZS
McQueen FM and Ostendorf B, AR&T 2006, 8:222
Szpik kostny w zwierzęcych modelach
zapalenia stawów
1.
Podczas wczesnych etapów kolagenowego zapalenia stawów (CIA)
(przed objawami zapalenia stawów) obserwuje się powiększenie
kanałów łączących szpik ze stawami oraz migrację nimi komórek
mezenchymalnych. Terapia anty-TNF blokuje te zjawiska.
Marinova-Mutachieva et al. 2002, Arthritis Rheum 46:507
2.
Podczas adjuwantowego zapalenia stawów DNA z mykobakterii jest
znajdowane w szpiku i śledzionie, ale nie w stawach.
Ronaghy et al. J.Immunol. 2002, 168:51
3.
Zapalenie stawów indukowane antygenem może być przeniesione do
zdrowych myszy przez przeszczep szpiku, co wskazuje na Kobayashi et al. J.
Rheumatol. 2002, 29:1176
4.
Efektywna prezentacja antygenu (kilkukrotnie lepsza niż w węzłach
chłonnych) zachodzi w szpiku kostym
M. Feuerer; Nat Med 2003; 1151-7
Szpik kostny w RZS
•
Udział podchrzęstnego szpiku w RZS
Bugatti et al. 2005, Arthritis Rheum 52: 3448
•
Obrzęk szpiku kostnego w RZS
McQueen and Ostendorf. Arthritis Res & Therapy. 2006, 8: 222,
•
Nadżerki kości i obrzęk szpiku kostnego
odzwierciedlają prawdziwe zapalenie szpiku w
RZS
Jimenez-Boj at al. Arthritis and Rheum. 2007, 56: 1118
Zagadnienia
• Mikrośrodowisko szpiku bogate w cytokiny
prozapalne promują dojrzewanie i aktywację
osteoklastów
• Subpopulacje limfocytów w szpiku kostnym: rola IL15?
• Komórki regulatorowe w szpiku kostnym
• Funkcjonalne receptory Toll-podobne (TLR) są
obecne na limfocytach B w szpiku kostnym
Elevated levels of TNFa in bone marrow
plasma from RA in comparison to OA
patients
1600
1400
1200
1000
pg/ml
800
600
400
200
0
Median
25%-75%
Min.-Max.
P=0,04
-200
OA
RA
Warnawin et al. in preparation
Elevated levels of IL-1β in bone marrow
plasma from RA in comparison to OA
patients
24000
22000
20000
18000
16000
pg/ml
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
Median
25%-75%
Min.-Max.
0
P=0,03
-2000
OA
RA
Warnawin et al. in preparation
Increased levels of IL-15 in RA bone marrow
A
B
1800
7,0
6,5
1600
1400
1200
*
1000
800
IL - 7 ( pg /ml)
IL-15 (pg/ml)
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
600
2,5
400
2,0
200
1,5
RA BM
OA BM
RA BM
OA BM
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010
(in press)
Soluble gp130 blocks IL-6/IL-6R active complex
IL-6
IL-6
sIL-6R
Active complex
sgp130
IL-6R
gp130
IL-6/sIL-6R/sgp130
- inactivated complex
signaling
Levels of IL-6, sIL-6R and sgp130 in bone marrow
isolated from RA and OA patients
IL-6
sIL-6R
sgp130
Higher levels of sIL-6R in RA than in OA
Higher levels of IL-6 in RA than in OA
700
sgp130/IL-6
Higher levels of sgp130 in RA than in OA
250
sgp130/sIL-6R
Ratio: sgp130/IL-6
Ratio: sgp130/sIL-6R
350
8
1000
600
900
300
200
7
800
6
500
250
100
200
200
150
Ratio: sgp130/sIL-6R
300
150
Ratio: sgp130/IL-6
400
sgp130 (ng/ml)
sIL-6R (ng/ml)
IL-6 (pg/ml)
700
600
500
400
5
4
3
300
100
2
200
50
100
50
1
100
0
0
RA
OA
OA
- RA
•
•
0
0
RA
RA
OA
0
RA
OA
RA
- OA
Lower level of sgp130 in RA compensate less IL-6 and sIL-6R than in OA
Thus, IL-6/IL-6Ra system forms better microenvironment in bone marrow to activate
asteooclasts in RA
OA
RANKL, RANK and OPG regulates maturation, activation and
survival of osteoclasts
Receptor activator of NF-kB ligand - RANKL
CFU- M
Receptor activator of NF-kB – RANK
preosteoclast
Osteoprotegerin - OPG
multinucleated
osteoclast
Pro-resorptive hormones,
Cytokines , growth factors
activated
osteoclast
Bone
osteoblasts or bone
marrow stromal cells
CFU- M
hormones,
cytokines,
growth factors
apoptotic
osteoclast
Bone
osteoblasts or bone
marrow stromal cells
Adapted from Boyle WJ, et al. Nature 2003; 423: 337- 42.
Levels of soluble RANKL and OPG in bone marrow plasma
OPG
n.s.
24000
20000
16000
12000
8000
4000
0
200
RANKL concentrations (pg/ml)
OPG concentrations (pg/ml)
28000
OA
RA
180
RANKL
P < 0.001
800
700
160
OPG/RANKL ratio
P < 0.001
600
140
500
120
400
100
80
300
60
200
40
20
100
0
0
OA
RA
OA
RA
Lower OPG/RANKL ratio in RA than in OA suggests that osteoclast
maturation/activation microenvironment in RA bone marrow
contributes to faster bone degradation
Radzikowska et al. in preparation
Wnioski:
Podwyższone poziomy cytokin prozapalnych
(TNF-a, IL-1 beta, IL-6, IL-15, IL-17)
oraz wyższy stosunek RANKL/OPG stwarza
w szpiku kostnym mikrośrodowisko
promujące zapalenie i degradację kości
Limfocyty T w szpiku kostnym w RZS
Increased absolute T cell number and CD4+/CD8+ ratio in rheumatoid
B
14000
CD3+CD4+ /CD3+CD8+ ratio
A
p<0.008
12000
*
10000
8000
6000
4000
2000
0
RA
OA
C
1,4
1.4
1,3
1.3
p<0.004
1,2
1.2
1,1
1.1
*
1,0
1.0
0,9
0.9
0,8
0.8
0,7
0.7
0,6
0.6
0,5
0.5
RA
OA
80
70
60
50
ESR
Number of CD3+ cells/ml of bone
marrow
arthritis (RA) bone marrow in comparison to osteoarthritis (OA)
p<0.05
40
30
R= - 0.54
20
10
0
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Number of CD3+ cells/μl of RA bone marrow
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010
(in press)
Increased expression of early activation marker CD69 on RA bone
marrow CD4+ and CD8+ T-cells
C
7
CD3+CD4+CD69+ (%)
6
5
#
*
P<0.05
RA BM
CD69
A
RA PB
5,5%
0%
P<0.005
4
3
OA BM
#
2
OA PB
0,3%
0%
1
0
-1
CD4
RA BM RA PB OA BM OA PB
20
CD3+CD8+CD69+ (%)
18
16
#
^
RA BM
D
P<0.01
RA PB
17,3%
0%
CD69
B
P<0.005
14
12
10
8
6
# P<0.005
OA BM
OA PB
0,3%
0%
4
2
0
-2
RA BM RA PB OA BM OA PB
CD8
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010
(in press)
Proliferation of bone marrow T cells triggered by IL-15
+ CD4CD4+
RACD3
CD3+
RA
RA
RA CD3
Cell number
CD3
OA CD3+
CD4+
+
+
OA CD3
CD3
CD4
+
CD4
+
CD3+
CD8+
+ CD8
+
+
OA
OA CD3
CD3
+
CD8
+
+ CD8
+
CD3+
CD4+
CD8
+
CFSE
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010
(in press)
Formation of germinal centers in early and advanced RA bone
marrow
Warnawin et al. Ann Rheum Duis 2010
(in press)
Czy komórki regulatorowe hamujące
odpowiedź immunologiczną są w szpiku
kostnym chorych na RZS?
Higher percentage of CD4+Foxp3+ cells in bone
marrow of OA than RA patients
2
P<0,05
1,8
% CD4+Foxp3+
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
OA
RA
Massalska et al. In preparation
Limfocyty T w szpiku kostnym chorych
na RZS
•
Aktywowane, limfocyty T CD4+, CD8+ są obecne w
•
Wykazuja wyższą ekspresję recptorów dla IL-15
•
Pod wpływem IL-15 proliferują i wydzielają IL-17
•
Zwiększone proporcje Th17 i IL-17
•
Obniżone poziomy FoxP3+, komórek regulatorowych Treg
•
Tworzenie w szpiku kostnym typowych dla węzłów chłonnych centrów
rozrodczych z aktywowanymi limfocytami T i B zarówno we wczesnym
jak i zaawansowanym RZS
Funkcjonalne receptory Toll-podobne 9
(TLR9)
są obecne w limfocytach B
pochodzących ze szpiku pacjentów z RZS
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
Indukcja i podtrzymywanie odpowiedzi immunologicznej:
dwa sygnały, kostymulacja, zagrożenie !!!
PAMP, DAMP- PRR: TLR,NLR,RLR,RAGE
(P. Matzinger 1994, 2004-2007)
bakteria
Sig.1
B
Sig.1
Kostymulacja (B7.1, B7.2, /CD28,
CD40/CD40L...)
Th
Help
(sygnał 2)
(IL-2, 4, 5....)
PPR- pattern recognition receptors
TLR- Toll-like receptors
NLR- NOD-like receptors
RLR- RIG-I-like receptors
RAGE- receptor for advanced glycation
end-products
TLR
Cytokiny
PAMP
Sygnały zagrożenia
(Cząsteczki DAMP)
komórka
uszkodzona
PAMP – pathogen associated molecular patterns
DAMP – damage associated molecular pattern
zdrowa
Ciałka apoptotyczne)
RA bone marrow-derived B-cells
express TLR9 at mRNA and protein levels
bone marrow
1
2
3
4
peripheral
blood
TLR9
(260 bp)
- RT
GAPDH
(196 bp)
TLR9
– saponin
TLR9
Isotype control
+ saponin
CD19
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
CpG-ODN, but not GpC-ODN, enhance directly and in
a dose-dependent manner, the expression of activation
markers (CD86 and CD54) on bone marrow B-cells
Control GpC-ODN
30 mg/ml
15 mg/ml
Agonistic CpG-ODN
30 mg/ml
CD19
Pure B-cells
culture
Control GpC-ODN
30 mg/ml
Untreated cells
CD54
BMMC
culture
CD86
Untreated cells
15 mg/ml
Agonistic CpG-ODN
30 mg/ml
CD19
Control GpC-ODN
Agonistic CpG-ODN,
15 mg/ml
Control GpC-ODN
Agonistic CpG-ODN,
15 mg/ml
Agonistic CpG-ODN,
30 mg/ml
Agonistic CpG-ODN,
30 mg/ml
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
CD54
CD86
Chloroquine (inhibitor of TLR9 signaling) inhibits CpGODN-triggered CD86 and CD54 expression on bone
marrow B-cells
CD19
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
CpG-ODN stimulate proliferation of bone marrow B-cells
in BMMC culture (increased Ki-67 expression and
diminished CFSE content in CD19+ cells)
n=4
n=3
Agonistic CpG-ODN, 30 mg/ml
Agonistic CpG-ODN, 15 mg/ml
Control GpC-ODN, 30 mg/ml
CD19-PE
D=0,24
CFSE
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
CpG-ODN induce IL-6 and TNF-a secretion
by bone marrow B-cells
350
500
TNF-a
(% of untreated control)
IL-6
(% of untreated control)
600
400
300
200
100
0
Niestymulowana kontrola
Kontrolny GpC-ODN
Stymulujący CpG-ODN
Untreated Control Agonistic
control GpC-ODN CpG-ODN
300
250
200
150
100
50
0
Niestymulowana kontrola
KontrolnyGpC-ODN
StymulującyCpG-ODN
Untreated Control Agonistic
control GpC-ODN CpG-ODN
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
Bone marrow CD20+ B-cells express TLR9
peripheral blood
CD20
bone marrow
TLR9
(% of CD19+ cells)
CD19
p=0.049
p=0.049
100
-
80
-
60
ns
-
40
20
-
0
TLR9
(Mean Fluorescence
Intensity)
CD20-
80
-
64
-
CD20low
CD20+
CD20+
CD20- CD20low CD20+
CD20+
bone marrow
peripheral
blood
ns
48
32
16
-
0
bone marrow
szpik kostny
peripheral
blood
krew obwodowa
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
Bone marrow CD20+ B-cells respond better to CpGODN stimulation than their peripheral blood counterparts
CD86
(% of unstimulated control)
400
p=0,049
350
n
BMMC
PBMC
300
250
200
150
100
50
0
2nd day of the cell culture
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
Higher frequency of bacterial DNA in bone marrow
samples from RA than OA patients
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
OA
RA
Rudnicka et al. Eur.J.Immunol. 2009,39,1211-20
B-cell maturation in bone marrow
Cells
Surface
antigens
Stem cells
TLR 9
Pro-B
Pre-B
Immature B
Mature B
Activated B Memory B
Plasma cell
?
(i) Limfocyty B pochodzące ze szpiku pacjentów z RZS wykazują
ekspresję funkcjonalnych receptorów TLR9, które uczestniczą w ich aktywacji,
produkcji TNF-a i IL-6, proliferacji i różnicowaniu do komórek o fenotypie
CD19+CD20+CD27high in vitro
(ii) IL-15 zwiększa: indukowany agonistami TLR9 (CpG-ODN) wzrost
ekspresji CD86 i CD54, proliferację i promuje dalsze różnicowanie limfocytów B
CD19+CD20+CD27high w kierunku komórek plazmatycznych
(CD138+CD19lowCD20low)
(iii) Podwyższona częstotliwość eubacteryjnego 16S-rybosomalnego
RNA in próbkach szpiku od pacjentów z RZS w porównaniu OA wskazuje na
rolę bakteryjnych infekcji w patogenezie RZS
(iv) Agonistyczne CpG-ODN poprzez TLR9 indukują ekspresje IL-15 i IL15Ra w jednojądrowych komórkach pochodzących ze szpiku (BMMC)
Te dane wskazują na udział ligandów TLR9 i IL-15 w
aktywacji szpikowych limfocytów B i sugerują udział w
patogenezie RZS
Wnioski
• Szpik kostny jest wtórnym organem limfatycznym, który
aktywnie uczestniczy w inicjacji i podtrzymywaniu
chronicznego zapalenia w RZS
• Przyszłe terapie RZS powinny brać pod uwagę szpik kostny
jako jedną z istotnych lokalizacji aktywowanych komórek
Podziękowania
Zakład Patofizjologii i Immunologii
Tomasz Burakowski
Ewa Kontny
Magdalena Chorąży-Massalska
Anna Radzikowska
Weronika Rudnicka
Ewa Warnawin
Maria Ziółkowska
Klinika Reumoortopedii
Paweł Małdyk
Cezary Michalak
Leszek Jung
Jacek Kowalczewski
Zakład Anatomii Patologicznej
Monika Prochorec-Sobieszek